银染技术的发明者是谁

㈠ 电泳技术在生物分离工程中的地位

早期的电泳技术是由瑞典Uppsala大学物理化学系教授提出了荷电的胶体颗粒在电场中移动的现象称其为电泳。于1937年，收ArneTiselius教授——诺贝尔奖金获得者，利用些电泳现象，发明了最早期的界面电泳，用于蛋白质分离的研究，开创了电沪泳技术的新纪元。此后，各种电泳技术及仪器相继问世，先进的电泳仪和电泳技术的不断发展，使它在生物化学实验技术中占重要地位，按电泳的原理有三种形式的电泳分离系统：原则上按电泳的原理来分，即移动界面电泳、区带电泳和稳态电泳或称置换（排代）电泳。在自由移动界面电泳，是带电分子的移动速率通过观察界面的移动来测定，该方法已成为历史。代之以采用支持介质的区带电泳。

区带电泳因所用支持体的种类、粒度大小和电泳方式等不同，其临床应用的价值也各有差异。固体支持介质可分为两类：一类是滤纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、矾土、纤维素等；另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。由于它们具微细的多孔网状结构，故除能产生电泳作用外，还有分子筛效应，小分子会比大分子跑得快而使分辨率提高。它的最大优点是几乎不吸附蛋白质，因此电泳无拖尾的现象。低浓度的琼脂糖电泳相当于自由界面电泳，蛋白质在电场中可自由穿透，阴力小，分离清晰，透明度高，能透过200～7000nm波长的着色区带的检测敏感性，为此第一类支持介质现已被第二类支持介质所替代。

稳太电泳或称置换电泳的特点是分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态，如等电聚焦和等速电泳。

区带电泳是临床检验领域中应用最广泛的技术，有重要临床意义，尤其是其他新技术，更扩大了其应用范围，提高了检测技术，现对该技术的现状与发展作一评述。

一、正确解释电泳结果，有助于临床疾病判断的参考

新鲜血清经电泳后可精确地描绘出患者蛋白质的全貌，一般常见的是白蛋白降低、某个球蛋白区域升高，提示不同的临床意义。如急性炎症时，可见a1，a2区百分率升高；肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现白蛋白下降，a2球蛋白升高，β球蛋白也升高；缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现β区带增高，医|学教育网搜集整理而慢性肝病或肝硬变呈现白蛋白显著降低，r球蛋白升高2-3倍，示免疫球蛋白多克隆增高，甚至可见β-r融合的桥连现象，还可在r区呈现细而密的寡克隆区带；对单一克隆浆细胞异常增殖所产生的无抗体活性均一的免疫球蛋白称M蛋白的检测，血清蛋白电泳是其首选的实验诊断方法。可在电泳区带的a2-r区呈现致密而深染，高度集中的蛋白克隆增生区带，称其为m蛋白区带，扫描后形成高而狭窄的单株峰，若些峰在r区其峰高与峰底宽之比>2：1，而由于正常免疫球蛋白合成限制造成背景染色浅。由M蛋白所导致的一组疾病如：多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病、游离轻链病、半分子病、良性单株丙球血症和双M蛋白血症等，目前这类疾病已不属罕见。血清蛋白电泳对这类疾病的早期诊断，疗效观察和预后判断均有十分重要的意义。

二、电泳技术与免疫技术相结合，大大扩大了其临床应用的范围

让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向、从而加快了沉淀反应速度。免疫电泳技术的种子类很多，如：对流免疫电泳（CIEP）、火箭免疫电泳（RIE）、电免疫扩散（EID）。在种免疫电泳方法牟基础上，又不断地派生出一些新的技术，如：免疫电泳（IEP）技术，1969年Alper与Johnson推荐免疫固定电泳（IFE）是一种包括琼脂糖凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个过程的操作，是免疫沉淀反应的一种混合技术，检测标本可以是血清、尿、脑脊液或其他体液。1976年血清免疫固定电泳（IF）技术再次被推荐，用于M蛋白的分型。血清蛋白质在琼脂糖凝介质上经电泳分离后，应用固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清，加于凝胶表面的泳道上，经孵育让固定剂和抗血清的在凝胶内渗透并扩散后，若有对应的原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考泳道和抗原抗体沉淀区带被氨基黑着色，根据电泳移动距离分离出单克隆组分，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。该技术的最大优势是敏感性达50-150mg/dl，操作周期短，仅需数小时，分辨率高，结果易于分析。现最常用于M蛋白的分型与鉴定，已列入临床实验室的常规检测工作。

三、电泳技术进行同工酶谱分析，提高诊断率

1、血清乳酸脱氢酶同工酶（iso-LDH）：测定LDH同工酶有电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制剂法和酶切法，但迄今用得取多的仍是琼脂糖凝胶电泳法。经电泳分离后要分离出五种同工酶区带，急性必肌梗塞发病后平均6hLDH1即开始升高，LDH1/LDH2≥1为心肌损伤的阳性决定性水平，肝癌时可见LDH5明显升高，各区带含量的确定，将经电泳分离后的同工酶谱采用扫描予以定量，其精确度明显高于用肉眼判断。

2、血清肌酸激酶同工酶（ISO-CK）；测定CK和CH-MB仍是目前用于证实急性心肌梗塞的道选指标。近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK=MB，其原理为抗M亚单位的酶活性，因为正常血清中几乎无CK=BB，故将此值乘以2可以认为大致代表CK-MB的活性。此法简单迅速，缺点是特异性差，如患者血清中存在CK-BB或者异常CK时，都将出现假性增高。不少作者报道异常CD-同工酶，一条称巨CK（Maxro-CK），它是CK-BB与免疫球蛋白的复合物，有IgG亦有IgA，在正常血清中Marco-CK仅占0.8%-1.6%.另一条称线粒体CK（CK-MT），CK-MT是结合在肌肉、脑、肝内的线粒体表面，可能是线粒体膜的碎片，在正常血清中CK-MT是不出现的，在心梗时亦不出现，只有当组织极度损伤，由于线粒体和细胞壁极度破坏，方可在血清中检出。由于Macro-CK和不典型的CK-MT均不能被M抗体所抑制，故当它们出现时，会导致CK-MB高于CK总活力的假性升高。使用电泳方法分离CK-MB，是根据CK-同工酶分子结构不同，医|学教育网搜集整理在电泳缓冲液中，所带电荷各异，可以从阴极到阳极将CK不同组份予以分离，其分别为CK-MM，CK-MB和CK-BB.电泳特点是当出现异常2同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，从电泳图谱上很容易发现，由扫描仪对各条酶进行扫描，报告各条区带所占百分比，结合总酶活力，求得区带的酶省略定值结果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中间，而CK-MT位置靠近阴极端，在CK-MM后面。这样不会将CK-BB和各种异常同工酶误认为是CK-MB而误诊，也可解决CK-MB假性增高的错误原因所在。为此，CK同工酶电泳是项非常实用的检验技术，具有十分重要的临床意义。

3、CK亚型同工酶：此外，CK-MB和CK-MM亚型测定常采用琼脂糖凝胶等电聚焦电泳或高压电泳，由于操作比一般电泳麻烦，故常规常测定尚无法普及。目前引进的自动电泳仪，有试剂盒提供，可作CK亚型分析，参考值：CK-MM1（57.7±4.7）%；CK-MM2为（26.5±5.3）；CK-MM3为（15.8±2.5）%；CK-MM3/CK-MM1比值为0.28±0.05（范围0.15-0.39），阳性决定性水平>0.5.AMI第一天血中以MM3为主，但第二天以后则以MM1为主。采用电泳法分离CKMB，CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2极微，一般比值近似是而非，在急性心肌梗塞后4-6hCKMB2亚型即在血循环中可被检测到，故MB2/MB1的比例明显升高，并早于总CK-MB片段的增高。当心肌梗塞缓解后此比便也逐渐下降。也可用于溶栓治疗后的病情观察。

四、结合酶免疫标记抗体技术，检测脑脊液内寡克隆区带

曾有作者报道采用二维电泳和银染进行CSF蛋白质的分离与鉴定，方法繁复，耗时，现采用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离CSF中的蛋白质，并经抗原和辣根过氧化物酶标记的特异性IgG抗体进行反应来鉴定“寡克隆区带”（OCB），经此酶免疫标记放大技术和显色步骤，蛋白质浓度达31-125ul/L即可予以检测，可使检测灵敏度提高了100倍，这样脑脊液无须浓缩，避免了在浓缩过程中蛋白质的丢失。可用于证实和分辨OCB免疫球蛋白及其型别。若在脑脊液标本中检出OCB，而其相应标本中未能检出区带，则为阳性，真实地反映是由中枢神经系统本身合成的免疫球蛋白，具有重要临床意义。它是一种定性检测，在多发性硬化症时，OCB是一个十分重要的标志物。但须将患者血清和CSF在同一天同步进行分析，以认证不同来源的免疫球蛋白。中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号，主要用于诊断的鉴别诊断中枢神经系统疾患如：多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、付肿瘤性脑炎、神经性梅素等。

五、利用固相内抗原、抗体反应分离脂蛋白（a），用于心、脑知管独立的危险因子的检测

该技术是利用抗原、抗体反应将电泳分离的脂蛋白予以鉴别。血清经琼脂糖凝胶电泳，再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。由于凝胶中脂蛋白等电点不同，不仅可区分a、前β和β区带，又因介质中含有抗脂蛋白（a）【LP（a）】抗体及阳离子存在，抗LP（a）与患者血清中LP（a）结合形成复合物，阳离子则抑制其他脂蛋白的泳动速度，LP（a）便与其他脂蛋白分离开来，使分辨十分清晰的LP（a）条带呈现在前β与γ区域之间，将阳性条带扫描后，可获得区带的面积及其百分含量，该方法使电泳技术趋于完美，大大减少了手工操作的弊端，既可予以半定量，又能将胶片保存，便于比较。提高对心、脑血管独立的危险因子——LP（a）检测的敏感性和特异性。

六、按分子量大小进行非浓缩尿蛋白电泳，区分尿蛋白类型

尿蛋白电泳可将尿液中各种蛋白质分离用于区分尿蛋白类型，可在无操作的情况下，协助临床判断肾脏损伤的部位。国内部分实验室采用SDS-PAGE盘状电泳进行尿蛋白分离，该法具有局限性，耗时，操作繁琐，标本要求高，尿液需预浓缩，不适于临床实验室广泛开展。SDS=AGE电泳不需预浓缩，尿蛋白电泳后呈现出中、高分子量蛋白区，带主要反应肾小球病变；呈现出低分子量蛋白区带，可见于肾小管病变及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿则可见到大、中、小各种分子量区带，示肾小球及肾小管均受累及。扫描仪可对电泳后尿液中蛋白质剖象进行扫描，求出百分比，以显示肾小球或肾小管损伤程度，其电泳图谱及扫描图形可作国资料永载，利于分析比较。医|学教育网搜集整理该技术的最大进步是尿液不需预浓缩，操作简便，结果清晰，仅需三小时即可完成试验，还备有完整的定性标准，易于量化，便于分析，对肾脏疾的诊断，鉴别诊断，指导治疗和判断愈合颇有价值。

近期发展起来的毛细管电泳是一种新型的区带电泳，又称毛细管带电泳。它是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离，他离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。毛细管电泳在检验医学中的应用也十分广泛，从所检测样品的来源看可分为尿样、血浆、血清、脑脊液、红细胞、其他体液或组织，以及实验动物活体等。从分离对象看包括蛋白质、多肽、氨基酸、糖、酶、DNA、寡核苷酸、病毒、小和生物活性分子、离子、药物及其代谢产物等。根据用途可分为临床疾病诊断、临床蛋白质分析、临床药物分析、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。由于它具有无法比拟的高效和快速性，因而受到越来越多科学家们的重视。

中国的电泳技术起步不算太晚，但由于种种原因，大多数实验室仍采用较落后的电泳设备。随着国际、国内科技发展的日新月异和检验医学发展的突飞猛进，电泳技术也在不断发展和更新，其在临床医学和分子生物学领域中有着极其广泛的应用价值，相信随着该技术的不断发展必将越来越受到同道们的青睐。

㈡ 什么是SRAP标记技术其原理是什么有哪些应用领域

the optimization of Srap tec-system and the application on analysis of genetic diversity of Chinese alligator
摘 要：基于PCR的分子标记技术很多，但均因自身缺点限制了发展和应用。
abstract：There're various technologies on PRC-molecular marker，whose development are all restrained by their inherited shortage.
一种新兴的分子标记技术－相关序列扩增多态性SRAP以其特有的优点得到日益广泛的应用，显示了良好的发展前景。as it ows a sui genetic advantage,a new burgeoning molecular marker tecnologe --相关序列扩增多态性SRAP is widely applied. 此技术目前较多应用于植物材料的遗传分析，本研究将通过对技术体系各影响因素进行调整，优化反应体系，比较DNA提取方法，调整银染技术，得到很好的扩增效果。this teconology is used to applied to anlynasis the heredity of plant-material.Our research will modify the effective aspects to optimize the reaction system and modify the 同时对SRAP的原理、特点及其对浙江长兴扬子鳄种群遗传多样性的分析进行了介绍。研究结果表明，SRAP同样可以用于动物遗传多样性分析，为其保护提供分子支持。SRAP技术将成为研究领域一个有力的工具。晕 好累 干活晚点继续

㈢ SSR 分子标记技术的实验过程

1）找个公司合成引物
2）提取DNA
3）PCR扩增
4）电泳检测，不要用琼脂糖，要用丙烯酰胺凝胶，变性非变性均可，大板小板都行，但大板效果更好点，小板做起来比大板省点事。
5）显影，一般用银染，NaON和碳酸钠均可。
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下面给你粘一点我论文里的步骤：

1.2. SSR引物
本研究SSR位点及其引物序列来自2011年发布的烟草高密度SSR遗传连锁图谱，在图谱中24个连锁群上按照间隔3~5cM的距离选取了位点并合成引物，共合成SSR引物697对，用于CMV标记筛选和遗传定位。
1.3. DNA提取
采用天根™ DNA提取试剂盒提取供试材料全基因组DNA。
1.4. PCR反应体系
PCR总反应体系为10µL，其中30~50 ng/µL DNA 模板1 µL，2×Mix 5µL，2µmol/L正反向引物混合工作液1µL，加ddH2O至10µL。所用试剂购自MBI。
PCR反应在96孔ABI Veriti梯度基因扩增仪上按以下程序运行：首先94°C预变性5min； 94°C 15s，55°C 15s，72°C 30s 32个循环；最后72°C延伸7min，4°C保存。
1.5. 电泳检测
完成PCR循环48h内，取2µL PCR产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压850v电泳90min。用稍加改进的NaOH银染方法对电泳后的聚丙烯酰胺凝胶进行染色显影。各种溶剂的配方和体积为：银染液，0.1%AgNO3溶液1L；显影液，16g NaOH，8mL 37%甲醛，加去离子水定容到1L；终止液，0.75%Na2CO3溶液1L。银染程序为：（1）去离子水冲洗15s；（2）银染8min；（3）去离子水冲洗15s；（4）在显影液中轻摇至显带；（5）放入终止液，终止显影。显影完成之后，将聚丙烯酰胺凝胶放置在阴凉通风处3~4h，待完全干燥后，在透射式看片机上用数码相机采集图像。

㈣ 端粒酶疗法发明人是谁

端粒酶疗法:是以抑制或激活端粒酶活性为手段的基因疗法。主要是用反专义核酸或核(ribozyme) 技术，抑制属端粒酶在抗癌方面;激活端粒酶在延缓人类体细胞衰老方面的应用。

端粒酶，又称端聚酶。端粒酶是一种自带RNA 引物的逆转录酶。生殖细胞、造血干细胞和肿瘤细胞含有较高的端粒酶活性。其活性可用聚合酶链反应(PCR) 技术扩增其酶促反应产物(即TRAP 法) ，然后辅以银染法测定之。端粒酶的存在使染色体末端得以完全复制。染色体端区(telomere) ，又称端粒。端区消失可能是人类细胞丧失复制能力的原因之一。端区是真核生物染色体末端的特殊结构。人类染色体末端普遍存在端区结构。人类染色体端区由进化上高度保守的DNA 重复序列TTAGGG组成，由端粒酶合成。

端粒酶疗法，主要是用反义核酸或核酶(ribozyme) 技术抑制端粒酶活性，诱导恶性细胞分化与凋亡;激活端粒酶在延缓人类体细胞衰老等方面各有应用价值。端粒酶疗法在医学中极为重要，目前，是国内外医学界研究热点。端粒酶疗法对肿瘤防治、诊断和延缓人类体细胞衰老等方面具有重要意义。

㈤ DNA银染方法的优化

DNA银染检测方法的改进
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【英文篇名】 Improvement of DNA Silver Staining Detection
【作者中文名】 李天翊; 张运峰; 范永山;
【作者英文名】 LI Tian-yi; ZHANG Yun-feng; FAN Yong-shan（Department of Life Science; Tangshan Teachers College; Tangshan Hebei 063000; China）;
【作者单位】 唐山师范学院生命科学系;
【文献出处】 唐山师范学院学报, Journal of Tangshan Teachers College, 编辑部邮箱 2009年 05期
期刊荣誉：ASPT来源刊 CJFD收录刊
【关键词】 PAGE; 银染; DNA检测; 影响因素;
【英文关键词】 PAGE; silver staining; DNA detection; influencing factors;
【摘要】 DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染检测技术是分子生物学实验中的一个难点。对点样量、固定时间、显色时间等因素进行了改进和优化,收到了较好的实验效果。
【英文摘要】 Silver staining for DNA polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) is one important but difficult technique in Molecular Biology.The influencing factors,inculding the quantity of sample application,stationary time,and imaging time,were optimized for the PAGE/silver staining technique.The good experimental results showed that the improved method was feasible and available.
【DOI】 CNKI:SUN:TSSF.0.2009-05-022

㈥ 蛋白质组组学研究的基本策略是什么

蛋白质组 蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein). 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目. 蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域. 蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制. 作为一门科学，蛋白质组研究并非从零开始，它是已有20多年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸. 多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨基酸组分分析等.
[编辑本段]蛋白质组学的研究内容
主要有两方面，一是结构蛋白质组学，二是功能蛋白质组学。其研究前沿大致分为三个方面：
① 针对有关基因组或转录组数据库的生物体或组织细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组学。
② 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理病理体系或过程的局部蛋白质组或比较蛋白质组学。
③ 通过多种先进技术研究蛋白质之间的相互作用，绘制某个体系的蛋白，即相互作用蛋白质组学，又称为“细胞图谱”蛋白质组学。
此外，随着蛋白质组学研究的深入，又出现了一些新的研究方向，如亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学等。
[编辑本段]蛋白质组学研究中的主要技术
1 双向凝胶电泳技术(2-DE)
双向凝胶电泳技术与质谱技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。
Unlu 等提出了一种荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白质组学分析方法。差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE 在技术上的改进，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE 技术已经在各种样品中得到应用。
2 高效液相色谱技术(HPLC)
尽管二维凝胶电泳（2-DE）是目前常用的对全蛋白组的分析方法，但其存在分离能力有限、存在歧视效应、操作程序复杂等缺陷。对于分析动态范围大、低丰度以及疏水性蛋白质的研究往往很难得到满意的结果。Chong 等使用HPLC/ 质谱比较分析恶性肿瘤前和癌症两种蛋白质差异表达。利用HPLC 分离蛋白质，并用MALDI-TOF-MS 鉴定收集的组分，从而在两种细胞中的差异表达中对蛋白质进行定量分析。多维液相色谱作为一种新型分离技术，不存在相对分子质量和等电点的限制，通过不同模式的组合，消除了二维凝胶电泳的歧视效应，具有峰容量高、便于自动化等特点。二维离子交换- 反相色谱(2D-IEC-RPLC)是蛋白质组学研究中最常用的多维液相色谱分离系统。
3 表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SEL-DI)技术
表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱技术于2002 年由诺贝尔化学奖得主田中发明，刚刚产生便引起学术界的高度重视。SELDI 技术是目前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台，其全称是表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-tof)。其方法主要如下：通常情况下将样品经过简单的预处理后直接滴加到表面经过特殊修饰的芯片上，既可比较两个样品之间的差异蛋白，也可获得样品的蛋白质总览。因此，在应用方面具有显著优势。SELDI 技术分析的样品不需用液相色谱或气相色谱预先纯化，因此可用于分析复杂的生物样品。SELDI 技术可以分析疏水性蛋白质，PI 过高或过低的蛋白质以及低分子质量的蛋白质( < 25 000) ，还可以发现在未经处理的样品中许多被掩盖的低浓度蛋白质，增加发现生物标志物的机会。SELDI 技术只需少量样品，在较短时间内就可以得到结果，且试验重复性好，适合临床诊断及大规模筛选与疾病相关的生物标志物，特别是它可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等， 从而可检测到样品中目标蛋白质的分子量、PI、糖基化位点、磷酸化位点等参数。
4 同位素标记亲和标签(ICAT)技术
同位素亲和标签技术是近年发展起来的一种用于蛋白质分离分析技术，此技术目前是蛋白质组研究技术中的核心技术之一。该技术用具有不同质量的同位素亲和标签( ICATs) 标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，利用串联质谱技术，对混合的样品进行质谱分析。来自两个样品中的同一类蛋白质会形成易于辨识比较的两个不同的峰形，能非常准确的比较出两份样品蛋白质表达水平的不同。ICAT 的好处在于它可以对混合样品直接测试；能够快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质，尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；还可以快速找出重要功能蛋白质。
由于采用了一种全新的ICAT 试剂，同时结合了液相色谱和串联质谱，因此不但明显弥补了双向电泳技术的不足，同时还使高通量、自动化蛋白质组分析更趋简单、准确和快速，代表着蛋白质组分析技术的主要发展方向。针对磷酸化蛋白分析以及与固相技术相结合ICAT 技术本身又取得了许多有意义的进展，已形成ICA T 系列技术。用具有不同质量的同位素亲和标签( ICATs) 标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，利用串联质谱技术，可对混合的样品进行质谱分析。
5 生物信息学
近年来，生物信息学在生命科学研究中起着越来越重要的作用。利用生物信息学对蛋白质组的各种数据进行处理和分析，也是蛋白质组研究的重要内容。生物信息学是蛋白质组学研究中不可缺少的一部分。生物信息学的发展，已不仅是单纯的对基因组、蛋白质组数据的分析，而且可以对已知的或新的基因产物进行全面分析。在蛋白质组数据库中储存了有机体、组织或细胞所表达的全部蛋白质信息，通过用鼠标点击双向凝胶电泳图谱上的蛋白质点就可获得
如蛋白质鉴定结果、蛋白质的亚细胞定位、蛋白质在不同条件下的表达水平等信息。目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST 数据库。NRDB 由SWISS2PROT 和GENPETP 等几个数据库组成，dbEST是由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和 欧洲生物信息学研究所(EBI)共同编辑的核酸数据库；计算机分析软件主要有蛋白质双向电泳图谱分析软件、蛋白质鉴定软件、蛋白质结构和功能预测软件等。

㈦ 急求！！DNA测序的问题

DNA测序技术
DNA sequencing technology
在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。
Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、 A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

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一、概述：
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。
Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。
退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。
由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03-- 2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。
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二、材料
待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。
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三、设备
高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。
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四、试剂
（1）SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。
（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。
（3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。
（4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。
（5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。
（8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。
（9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
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五、操作步骤
：
成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点：
（1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。
（2） 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。
（3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。
（一）测序反应：
1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂：
（1） 样品反应：
质粒模板DNA 2.1pmol
5×测序缓冲液 5ml
引物 4.5pmol
无菌ddH2O 至终体积16ml
（2）对照反应
pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 4.0ml
5×测序缓冲液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
无菌ddH2 O 至终体积 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
[注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板种类/长度 模板量
200bp (PCR产物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数
计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数
3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。
模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%
95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。
模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。
（二）、 测序凝胶板的制备
1、玻璃板的处理：
银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
（1）短玻璃板的处理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。
B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。
C. 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。
2. 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。
(2)、长玻璃板的处理
A. 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。
B. 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。
[注意] 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。
2、凝胶的制备：
（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的 TEMED和过硫酸铵。
凝胶终浓度
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE缓冲液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
双蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
(3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。
（三）电泳：
1、预电泳
（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。
（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。
（5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。
[注意]
（1）. 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。
（2）. 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。
2、样品的制备：
当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4- 6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
3、上样及电泳
关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、 T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长， 0.2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。
[注意]
1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。
2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。
（四）、 测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影：
(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3). 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
[注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。
1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。
2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。
3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。
4. 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。
5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。