引物设计原理

A. 简述引物设计的基本原则

1.PCR技术基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 3.PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 4.PCR的特点：特异性强。对标本的纯度要求低。灵敏度高。 5.PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。

B. 引物设计的引物设计原则

1、长度：15—30bp，其来有效长度[Ln=2(G十源C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。
2、G十c含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。
3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。
7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。
8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。

C. 引物设计原理的设计流程

先进行序列下载，然后进行 同源性比较 ，最后进行引物设计筛选 。

D. 荧光定量pcr引物设计原理

如果你测定的基因序列未知，可以用同源基因或者别的物种的同类基因序列来设计引物，进行pcr，看看是否能够扩增出产物，并对产物进行确认，判断扩增的特异性。
如果确认无误，就可以进行荧光定量pcr。

E. 简并引物是什么设计的原则或原理是什么

利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列 因为密码回子的关系，不同是指代表编码答单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。密码子具有简并性，单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不精确的，但可以设计成对简并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用简并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的

F. pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则有哪些

PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：

PCR的技术的主要步骤：

1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

2、引物设计的基本原则

1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

3、引物内部不应出现互补序列。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

(6)引物设计原理扩展阅读

PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR、竞争PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

第一代PCR就是常见的定性PCR技术，它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR），它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。

第三代PCR技术--数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。

PCR芯片技术PCR仪器发展的趋势之一变得更加微型化，PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片就是在微型的载体上进行PCR反应，是微型化的PCR仪。芯片PCR不仅节省了大量反应试剂因此降低了实验成本，还有助于提高反应速度。

G. 反向PCR引物设计的原理怎样设计反向pcr的引物谢谢！！急急

cdna是单链，做race分3‘端和5’端两种情况。同时真菌与细菌mrna有差别。因此，设计race引物是有学问的。根据你自己的情况，好好设计吧。祝好运！

H. 多重pcr引物设计的原理有哪些

• 1、多杀性巴氏杆菌的Km t 及toxA 基因 T +Pm具有Km t 及toxA 基因 T Pm具有Km t基因 PCR引物：

• P1: 5′- A TC CGC TA T TTA CCC A GT GG-3′ P2: 5′-GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC-3′ P3: 5′- CTT A GA TGA GCG ACA A GG-3′ P4: 5′- GAA TGC CAC ACC TCT A TA G-3′ 引物P1，P2检测Pm,扩增片段为457bp; 引物P3，P3检测T +Pm，扩增片段为864bp.

• 退火温度56℃，时间30秒

• 2、禽多杀性巴氏杆菌基因序列（U51470） 引物：

• 上游引物：5’-TGC CAA AGT TGC CAA TAC TCC-3’ 下游引物：5’-TCC CGT CCT CAT TTC TTG CG-3’

• 退火温度45℃，时间1分钟

• 3、猪巴氏杆菌

• 参考GenBank中猪巴氏杆菌序列设计引物

• 上游PAS1：5’-AgggCACgCAggCggACTTTTA-3’ 上游PAS2：5’-ATCgACAgCgTTTACAgCgTggA-3’

• 退火温度56.5℃，时间1分钟

• 4、致病性嗜水气单胞菌（ 嗜水气单胞菌标准株Ah10501）

• 究针对GenBank 中登录的致病性嗜水气单胞菌的溶血素基因( hlyA ) 、气溶素基因( aerA ) 以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA 保守区设计了3 对特异性引，非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA 和aerA ,而致病性分离株则至少含有hlyA 基因

I. PCR的原理是什么，它有什么用途

PCR的原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

PCR最有价值的应用领域就是对感染疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

(9)引物设计原理扩展阅读

标准的PCR过程分为三步：

1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

J. 简并引物是什么设计的原则或原理是什么在线等，急！！！

http://ke..com/view/3796392.htm?fromTaglist
中文名称：
简并引物
英文名称：
degenerate primer
定义：
获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特内点容是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。
应用学科：
生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）