dnaman设计引物
两个生物信息学很常用的软件，可以网络下它们的说明书，里面有比较详细的讲解。就是如果是纯自学的话可能得费点力
B. 用DNAman分析引物时，Thermo Tm、Hybridization Tm、GC+AT Tm分别是什么意思急！！！
The melting temperature of an oligonucleotide is
calculated with three methods:
1)Thermodynamic Tm:
The Tm is calculated using the nearest-neighbor
thermodynamic values method (Breslauer et al). This method is less accurate for
longer oligos. The formula for the Tm is
Tm=dH/(dS-Rln(Cd))-273.15+16.6*(log10(Cs))
Where dH is the enthalpy, dS is the
entropy, R is 1.987 cal K-1 mol-1, Cd is the
DNA concentration, and Cs is the salt concentration.
2)Hybridisation Tm:
This method is generally used for DNA or RNA
hybridization, especially in presence of high salt and formamide. It is more
accurate with longer oligos. The Tm is calculated using the following
formula:
for DNA:DNA hybridization:
Tm=81.5+16.6*(log10[Na+])+0.41*[%(G+C)]-0.63*(%Formamide)-500/L-1.5(%Mismatch)
for DNA:RNA hybridization:
Tm=79.8+18.5*(log10[Na+])+0.58*[%(G+C)]+11.8*[%(G+C)]2-0.5*(%Formamide)-820/L-1.5(%Mismatch);
for RNA:RNA hybridization:
Tm=79.8+18.5*(log10[Na+])+0.58*[%(G+C)]+11.8*[%(G+C)]2-0.35*(%Formamide)-820/L-1.5(%Mismatch);
* where L is the length (bases) of the
oligonucleotide.
3)GC+AT Tm: the estimated Tm is the sum of
the contribution of each base: 2° for A and T and 4°C for G and C.
There are several parameters involved in Tm
calculation.
DNA concentration is used only in
thermodynamic Tm. You may increase oligo DNA concentration in order to increase
Tm.
Salt concentration affects thermodynamic Tm
and hybridization Tm. In the [Na+][mM] box, you may type a suitable salt
concentration of your experiments. The value must be an integer greater than
0.
Hybridization type is required for
Hybridization Tm. In the DNA/RNA box, enter the hybridization type:
C. 如何使用DNAMAN去确定引物在基因序列上结合的位置
在创口上部菜单栏中找到有search 功能的按键，会弹出一个小文本框窗口，输入你的内引物序列，然后让容它寻找(search)。但是要注意引物有正义链与反义链输入的区别。
不知道你的引物是普通的25个碱基，还是30个碱基以上的超长引物。后者引物可以用alignment(比对)试试。不过也要注意正义、反义链的输入。
D. 有哪位学长学姐会用DNAMAN设计PCR引物啊，老师留的作业，看了几天书完全不会
你拿着DNAMAN玩两天，就什么都会了，这个东西不当面教你，会费很多笔墨，大家都是自己拿着软件鼓捣出来的，多练练吧。
E. 用DNAMan设计的引物，其中有一条为GAGAGGAAGGAGAAGAGAATGG，只含3种碱基，没有C，不知道这种引物可用吗
挺好的，帮你测试了下
Primer 1
--------
Primer: GAGAGGAAGGAGAAGAGAATGG
Length: 22
%GC: 50.0
Tm: 58.5 deg C
1 礸 of primer: 143.378 pMole ends
Self-annealing: maximum score = 4
GAGAGGAAGGAGAAGAGAATGG
||
GGTAAGAGAAGAGGAAGGAGAG
3' end score = 1
GAGAGGAAGGAGAAGAGAATGG
:
GGTAAGAGAAGAGGAAGGAGAG
F. 如何用dnaman软件设计引物及找到引物上的酶切位点
1）PCR 引物设计
首先，将目标 DNA 片段装入 Channel,并激活 Channel。点击主菜单栏中的 Primer 主菜
单，出现下
拉菜单，如下所示：
点击 Design PCR Primers for DNA 命令，出现下列对话框： 参数说明如下：
Primer locations on target 引物定位
其中包括下列选项：
Proct size（扩增目的片段大小）
Sense primer (正向引物选择区)
Antisense primer(反向引物选择区)
Primer 引物特性包括 Length(引物长度)，Tm 值, GC 含量等参数；
Reject primer 引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）
包括下列选项：
3’dimer(可形成 3’端自我互补的碱基数)
Hairpin stem(可形成发卡颈环结构的碱基数)PolyN(多聚碱基)
3’Uique(3’端严格配对碱基数)
Primer-Primer(含义未知)
All matches(引物互补配对百分数)
Consentrations 浓度设定
Proct for hybridyzat（ion） PCR 产物用于 Southern Blot 探针杂交
点击按钮，出现下列对话框：
.选择需要的选项，点击按钮，出现：
点击按钮，完成操作。
2）DNA 序列的限制性酶切位点分析
将待分析的序列装入 Channel，点击要分析的 Channel，然后通过 Restriction/Analysis
命令打开对
话框，如下所示：
参数说明如下：
Results 分析结果显示
其中包括：
Show summary（显示概要） Show sites on sequence（在结果中显示酶切位点）
Draw restriction map（显示限制性酶切图）Draw restriction pattern（显示限制性酶
切模式图）
Ignore enzymes with more than（忽略大于某设定值的酶切位点）
Ignore enzymes with less than（忽略小于某设定值的酶切位点）
Target DNA （目标 DNA 特性）
circular（环型 DNA），dam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）
all DNA in Sequence Channel（选择此项，在 Sequence Channel 中的所有序列将被
分析，如果
选择了 Draw restriction pattern，那么当所有的 channel 中共有两条 DNA 时，则只能选择两个酶
分析，如果共有三个以上 DNA 时，则只能用一个酶分析。
选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下列对话框：
参数说明如下：
Enzyme
代表（enzyme data file），点击旁边的下拉按钮，出现两个默认选项，restrict.enz 和
dnamane.enz，
如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文件名。其中 restrict.enz 数据文件包
含 180 种
限制酶，dnamane.enz 数据文件包含 2524 种限制酶。选择其中一个数据文件，相应的
酶在左边的
显示框中列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则对应的酶被选中，在右边空白
框中列
出。要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例如 puc18 multiple
cloning sites），
然后点击按钮出现下列对话框：
输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切
位点。
Cutter 酶切识别序列长度；End 酶切产生的末端，其中包括，Blunt（平头末端），
5’Overhang
（5’突出粘性末端）,3’Overhang(3’突出粘性末端)，系统根据 cutter 和 end 的设定情
况,在左边酶列表
中显示符合条件的酶。最后，点击按钮执行操作。
G. PCR引物设计原则，要详细的。Primer5.0与DNAMAN哪个更全面
PCR引物设计的11条黄金法则
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
1)避免重复碱基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
H. 如何用dnaman软件设计引物及找到引物上的酶切位点
1） 引物设计
首先，将目标 DNA 片段装入 Channel,并激活 Channel。点击主菜单栏中的 Primer 主菜
单，出现下
拉菜单，如下所示：
点击 Design PCR Primers for DNA 命令，出现下列对话框： 参数说明如下：
Primer locations on target 引物定位
其中包括下列选项：
Proct size（扩增目的片段大小）
Sense primer (正向引物选择区)
Antisense primer(反向引物选择区)
Primer 引物特性包括 Length(引物长度)，Tm 值, GC 含量等参数；
Reject primer 引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）
包括下列选项：
3’dimer(可形成 3’端自我互补的碱基数)
Hairpin stem(可形成发卡颈环结构的碱基数)PolyN(多聚碱基)
3’Uique(3’端严格配对碱基数)
Primer-Primer(含义未知)
All matches(引物互补配对百分数)
Consentrations 浓度设定
Proct for hybridyzat（ion） PCR 产物用于 Southern Blot 探针杂交
点击按钮，出现下列对话框：
.选择需要的选项，点击按钮，出现：
点击按钮，完成操作。
2）DNA 序列的限制性酶切位点分析
将待分析的序列装入 Channel，点击要分析的 Channel，然后通过 Restriction/Analysis
命令打开对
话框，如下所示：
参数说明如下：
Results 分析结果显示
其中包括：
Show summary（显示概要） Show sites on sequence（在结果中显示酶切位点）
Draw restriction map（显示限制性酶切图）Draw restriction pattern（显示限制性酶
切模式图）
Ignore enzymes with more than（忽略大于某设定值的酶切位点）
Ignore enzymes with less than（忽略小于某设定值的酶切位点）
Target DNA （目标 DNA 特性）
circular（环型 DNA），dam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）
all DNA in Sequence Channel（选择此项，在 Sequence Channel 中的所有序列将被
分析，如果
选择了 Draw restriction pattern，那么当所有的 channel 中共有两条 DNA 时，则只能选择两个酶
分析，如果共有三个以上 DNA 时，则只能用一个酶分析。
选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下列对话框：
参数说明如下：
Enzyme
代表（enzyme data file），点击旁边的下拉按钮，出现两个默认选项，restrict.enz 和
dnamane.enz，
如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文件名。其中 restrict.enz 数据文件包
含 180 种
限制酶，dnamane.enz 数据文件包含 2524 种限制酶。选择其中一个数据文件，相应的
酶在左边的
显示框中列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则对应的酶被选中，在右边空白
框中列
出。要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例如 puc18 multiple
cloning sites），
然后点击按钮出现下列对话框：
输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切
位点。
Cutter 酶切识别序列长度；End 酶切产生的末端，其中包括，Blunt（平头末端），
5’Overhang
（5’突出粘性末端）,3’Overhang(3’突出粘性末端)，系统根据 cutter 和 end 的设定情
况,在左边酶列表
中显示符合条件的酶。最后，点击按钮执行操作。
I. 如何用DNAman 软件设计引物
DNAMAN软件可以设计引物吗？建议用primer 5或者oligo 6
J. 如何利用dnaman设计简并引物
在创口上部菜单栏中找到有search 功能的按键，会弹出一个小文本框窗口，输入你的引物序内列，然后让容它寻找(search)。但是要注意引物有正义链与反义链输入的区别。 不知道你的引物是普通的25个碱基，还是30个碱基以上的超长引物。