多重pcr引物设计

A. 如何利用多重pcr扩增一条长片段

如何利用多重pcr扩增一条长片段
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同专一PCR反应体系里加上二属对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

B. 几种PCR区别及引物问题求教

详细内容可上试吧商城！！
Hot start PCR：
热启动 PCR，是提高 PCR 特异性和可信度的最好的方法之一。通过阻止温度升高到变性温度前的 PCR 反应的发生而阻止引物与基因组 DNA 上潜在的高同源性区域结合引起的错误引发（mispriming）。同时热启动还使引物通过互补区域碱基配对而扩增产生的引物二聚体量大大降低。 热启动 PCR 可通过三种方式实现：
1) 手动热启动：配置反应液时忽略一种关键成分（聚合酶、Mg 离子或 dNTP），当反应液升温到 80℃以上或变性温度时再加入。手动热启动操作繁琐，而且因为增加了一次开盖操作，增加了污染的机会，同时由于管与管间的加样误差，可能使平行样品间扩增结果产生差异；更简单的手动热启动是在冰上配置反应液，待热盖升温到变性温度，按下扩增仪的暂停键，立即将反应管放在仪器上开始反应，当然这种方法的可信度也最低
2) 将聚合酶用石蜡珠包裹（或在反应液上部滴一滴融化的石蜡，待其凝固后，将聚合酶加到石蜡层的上部）使其与反应液的其它成分分开，直到反应液升温融化石蜡后，酶才进入反应液中；
3) 使用热启动 DNA 聚合酶，这种酶通过化学修饰或与抗体结合，常温下没有活性，而只有当反应液加热到变性温度一段时间后，酶的活性才被释放。使用热启动 DNA 聚合酶相比手动热启动操作简便，缺点是用热启动 DNA 聚合酶的价格较高。
Touchdown PCR：
降落 PCR，是另一种简单的降低非特异性扩增的方法，可规避对 PCR 循环条件进行耗时的优化实验。降落 PCR 过程中，首轮循环的退火温度设置在比引物的解链温度高出几度，使每个后续循环的退火温度逐渐降到，直到退火温度降到等于引物的解链温度或比引物的解链温度低几度，后续的循环在此较低的退火温度下完成，整个程序的退火温度可降低 10-15℃。
在最初几个循环内，高温使引物的非特异性结合难以发生，只有同引物互补程度最大的模板序列（很可能这一序列就是我们感兴趣的序列）才能发生退火事件，因此保证靶序列得到优先扩增。后续循环降低退火温度可保证扩增效率，尽管最终的退火温度降低到足以使非特异性产物有效扩增的温度，由于靶分子已经开始指数期扩增，因此抑制非特异性产物的进一步形成。
Nested PCR：
巢式 PCR，通过使用两套引物来进行两次连续的反应，用来增加 DNA 扩增的特异性。在第一次反应中产生的产物可能包含非特异性扩增产物，然后使用两个新的、结合位点位于原引物内部的引物进行第二次反应。第二套引物的使用可提高反应的特异性，增大单一产物产生的可能性。巢式 PCR 在提高特异性的同时，也增加了检测的灵敏度。
Multiplex-PCR：
多重 PCR，指在一个 PCR 管中使用多对引物同时扩增超过一个的靶基因。同时分析单拷贝基因组的多个基因可避免分别扩增这些靶基造成对试剂和模板的浪费。使用多重 PCR 检测引起遗传疾病的基因突变时，可以同时扩增 6 个以上的靶点，也可同时检测食品中多种病原菌的存在。在多重 PCR 基础上发展的 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重连接探针扩增技术) 使用单对引物即可完成对多个靶基因的扩增，避免了多重 PCR 耗时的优化步骤。
Long PCR（Long distance PCR，Long range PCR）：
长距离 PCR，普通的 Taq 聚合酶一般只能扩增不超过 3-5kb 的片段，通过使用特定的聚合酶和缓冲液成分，来扩增较长的 DNA 链（10-40kb 以上）。长距离 PCR 时经常会在 10-15 个循环后，使每个循环的延伸时间都比上一循环的时间增加 10 秒左右，以补偿聚合酶活性的损失。
Clony PCR：
菌落 PCR，通过 PCR 手段来迅速筛选阳性克隆子。使用灭菌的牙签将菌落直接挑到反应混合液中，通过 PCR 预变性步骤的高温使细菌的基因组释放作为 PCR 反应的模板。菌落 PCR 中使用的引物定位在插入位点外侧的载体区，因此尽管插入的序列各不相同，也不影响扩增反应的进行。
RT-PCR（Reverse Transcription PCR）：
逆转录 PCR，是用来扩增、分离和鉴定细胞或组织的信使 RNA（mRNA）的技术。反应由两个阶段组成：
1. 使用逆转录酶，通过逆转录反应“RT”合成与 RNA 互补的 cDNA（complementary DNA）
2. 使用 PCR 扩增特异性的 cDNA。
由于 PCR 的预变性步骤可以用来失活逆转录酶，所以两个阶段可在同一管内完成。一些 DNA 聚合酶如 Tth 也有 RT 活性，因此可以单独使用这种酶来完成两步反应。
RT-PCR 可广泛用于表达图谱分析（用来确定基因的表达）；鉴定 RNA 转录子的序列，当相关的基因序列已知时，还可进一步知道基因组上外显子和内含子的位置；检测病毒例如 HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。
RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends）：
一种 RT-PCR 方法，当对 DNA 序列信息了解较少时，使用单个特异性引物加一个接头引物来扩增 cDNA 的 5'端（对应转录的起始位点）或 3' 端从而产生新的 cDNA，重叠的 RACE 产物可结合起来产生全长的 cDNA 片段。
DD-PCR (differential display)：
差异显示技术，用来鉴定不同组织中差异表达的基因。将不同组织的 RT-PCR 产物用短的、非特异性引物进行扩增，然后在凝胶上比对来源于不同组织的条带，只在某种组织中才出现的条带被认为是差异表达的。
Asymmetric PCR：
不对称 PCR，可选择性的扩增出靶 DNA 的一条链，从而用于测序反应或制备单链杂交探针。反应中限制一个引物的加入量，随着这一引物的用尽，后续的扩增中另一引物延伸的产物量大大过量。这一技术的关键是使用的限制引物的量要合适，引物量过多，则产物主要是双链 DNA；引物量过少，在前几轮循环就被耗尽，结果导致单链的产量减少。在不对称 PCR 的基础上发展出 Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR，线性指数 PCR)，使数量限制的引物比过量的引物的解链温度更高，从而维持较高的反应效率。
Assembly PCR(也称作 Polymerase Cycling Assembly 或 PCA)：
通过使用多个具有短重叠区的长的寡核苷酸来合成长的 DNA 链的方法。通过寡核苷酸产生一条条正向或反向 DNA 链，而寡核苷酸的重叠区则确定链组装的顺序，因此可有选择性的产生最终的长链 DNA 分子。
Methylation-specific PCR (MSP)：
甲基化特异性的 PCR，用于研究基因组 CpG 岛的甲基化模式。首先是用亚硫酸氢钠处理靶 DNA，使未甲基化的胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物识别成胸腺嘧啶，然后分别用能区分修饰和非修饰模板的不同的引物来扩增（一对可识别胞嘧啶引物扩增原来甲基化的模板，令一对可识别尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物扩增非甲基化的模板）。结合定量 PCR，可以对甲基化程度进行定量。
Ligation-mediated PCR：
连接介导 PCR，首先使用小的寡核苷酸接头连接靶 DNA 片段，然后选择与接头结合的 PCR 引物来扩增未知的靶片段。这一技术主要用在 DNA 测序、染色体步移技术（genome walking）和 DNA 指纹图谱等。
AFLP（Amplified fragment length polymorphism）：
扩增片段长度多态性，通过扩增使不同生物基因组呈现不同长度的片段。
AP-PCR (arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA)：
机扩增多态性 DNA，使用随机寡核苷酸片段来扩增序列未知的靶基因，形成基因组指纹图谱，用来分析物种的相关性。
Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR：
可变数目串联重复序列 PCR，使引物定位在具有长度多态性的靶基因区，通过在凝胶电泳后对产物的大小进行分析来研究基因分型。
Allele-specific PCR：
等位基因特异性 PCR，设计引物时选择在基因组的多态性区域，使等位基因的突变定位在（或接近）引物的 3' 端，在严谨的反应条件下，存在错配碱基的引物不能起始复制，而只有完全匹配的引物才能起始复制，产生的产物因此显示不同的基因型。
InterSequence-Specific PCR(ISSR-PCR)：
一种 DNA 指纹图谱技术，所选的引物定位在基因组的片段重复区（如 Alu 族），扩增后产生基于不同产物长度的唯一的指纹图谱。
Inverse PCR：
反向 PCR，允许扩增已知序列侧翼的 DNA 区。首先将靶 DNA 用限制性内切酶进行多轮消化，然后连接被消化的片段构建环状的分子，引物设计成可从序列已知的区域向外侧延伸，结果扩增出环状分子上剩余的序列。
Quantitative PCR(Q-PCR)：
定量 PCR，用来测定样本中的靶 DNA 的量。最初的定量 PCR 主要是指 Competitive PCR（竞争定量 PCR）。竞争定量 PCR：在反应混合物中加入起始拷贝数已知的内部对照，对照具有同靶序列相同的引物结合位点，但产生的产物长度与靶序列产生的产物长度不同，在 PCR 过程中对照与靶基因竞争相同的引物。反应后通过比对对照和靶基因产生的产物量推断初始靶基因的拷贝数，由于内部对照和靶基因在扩增中的效率不一定相同，所以定量结果会产生偏差。
Real-Time PCR：
实时 PCR，由于通常的 PCR 在几十个循环后都会进入平台期，产物的量与初始模板量不在成正比，因此只能用来定性。而实时 PCR 通过使用荧光染料，例如 SYBR Green 或荧光标记探针，例如 TaqMan 可用来检测随着扩增的进行，产物量的变化而进行定量。

C. 有谁做过通用荧光引物多重PCR吗做过的可以指点一下，谢谢咯！

普通的SYBR green 法不能做来这种实验，只自有Taqman 探针才可以，ABI的仪器有5通道的，理论上可以做四个荧光同时检测，但是实际上不赞成这么做，一般同时做两个没问题，但是你的探针要设计好才行，也可以直接买ABI的成熟产品

D. 多重pcr如何设计引物

我们实验室有很多人做多重PCR，其实也很简单。如果你有3对引物进行PCR，第一保证每对引物单独专扩增没有问题。属第二保证引物对之间的退火温度相差不大，最好在3度内。第三，引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△G的绝对值小于5。推荐使用oligo软件设计引物，使用说明网络文库有很多。当然，如果单对引物设计还存在问题，可以看如下链接http://wenku..com/view/12389815fc4ffe473368ab58.html，里面介绍的很详细。

E. 多重pcr引物设计应注意哪些问题

设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度专：以200-500bp为宜，特定条件属下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，
被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，
这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

F. 多重pcr引物设计的原理有哪些

• 1、多杀性巴氏杆菌的Km t 及toxA 基因 T +Pm具有Km t 及toxA 基因 T Pm具有Km t基因 PCR引物：

• P1: 5′- A TC CGC TA T TTA CCC A GT GG-3′ P2: 5′-GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC-3′ P3: 5′- CTT A GA TGA GCG ACA A GG-3′ P4: 5′- GAA TGC CAC ACC TCT A TA G-3′ 引物P1，P2检测Pm,扩增片段为457bp; 引物P3，P3检测T +Pm，扩增片段为864bp.

• 退火温度56℃，时间30秒

• 2、禽多杀性巴氏杆菌基因序列（U51470） 引物：

• 上游引物：5’-TGC CAA AGT TGC CAA TAC TCC-3’ 下游引物：5’-TCC CGT CCT CAT TTC TTG CG-3’

• 退火温度45℃，时间1分钟

• 3、猪巴氏杆菌

• 参考GenBank中猪巴氏杆菌序列设计引物

• 上游PAS1：5’-AgggCACgCAggCggACTTTTA-3’ 上游PAS2：5’-ATCgACAgCgTTTACAgCgTggA-3’

• 退火温度56.5℃，时间1分钟

• 4、致病性嗜水气单胞菌（ 嗜水气单胞菌标准株Ah10501）

• 究针对GenBank 中登录的致病性嗜水气单胞菌的溶血素基因( hlyA ) 、气溶素基因( aerA ) 以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA 保守区设计了3 对特异性引，非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA 和aerA ,而致病性分离株则至少含有hlyA 基因

G. 多重pcr所用的引物可以用于普通pcr吗

一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴内定·多重PCR(multiplex PCR)，又容称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同·

H. 多重PCR引物设计

这个要看你准备设计多少重了，如果是做taqman定量PCR，一般也就2-4重，引物之间互相干扰专比较小，如果是做毛细管属电泳，那一般在5-40重，引物之间影响就比较大了

如果需要设计定量PCR引物，可以参考网页链接

I. 怎么用primer 5设计 multiplex PCR的引物

你先了解下多重PCR