銀染技術的發明者是誰

㈠ 電泳技術在生物分離工程中的地位

早期的電泳技術是由瑞典Uppsala大學物理化學系教授提出了荷電的膠體顆粒在電場中移動的現象稱其為電泳。於1937年，收ArneTiselius教授——諾貝爾獎金獲得者，利用些電泳現象，發明了最早期的界面電泳，用於蛋白質分離的研究，開創了電滬泳技術的新紀元。此後，各種電泳技術及儀器相繼問世，先進的電泳儀和電泳技術的不斷發展，使它在生物化學實驗技術中占重要地位，按電泳的原理有三種形式的電泳分離系統：原則上按電泳的原理來分，即移動界面電泳、區帶電泳和穩態電泳或稱置換（排代）電泳。在自由移動界面電泳，是帶電分子的移動速率通過觀察界面的移動來測定，該方法已成為歷史。代之以採用支持介質的區帶電泳。

區帶電泳因所用支持體的種類、粒度大小和電泳方式等不同，其臨床應用的價值也各有差異。固體支持介質可分為兩類：一類是濾紙、醋酸纖維素薄膜、硅膠、礬土、纖維素等；另一類是澱粉、瓊脂糖和聚丙烯醯胺凝膠。由於它們具微細的多孔網狀結構，故除能產生電泳作用外，還有分子篩效應，小分子會比大分子跑得快而使解析度提高。它的最大優點是幾乎不吸附蛋白質，因此電泳無拖尾的現象。低濃度的瓊脂糖電泳相當於自由界面電泳，蛋白質在電場中可自由穿透，陰力小，分離清晰，透明度高，能透過200～7000nm波長的著色區帶的檢測敏感性，為此第一類支持介質現已被第二類支持介質所替代。

穩太電泳或稱置換電泳的特點是分子顆粒的電泳遷移在一定時間後達到穩態，如等電聚焦和等速電泳。

區帶電泳是臨床檢驗領域中應用最廣泛的技術，有重要臨床意義，尤其是其他新技術，更擴大了其應用范圍，提高了檢測技術，現對該技術的現狀與發展作一評述。

一、正確解釋電泳結果，有助於臨床疾病判斷的參考

新鮮血清經電泳後可精確地描繪出患者蛋白質的全貌，一般常見的是白蛋白降低、某個球蛋白區域升高，提示不同的臨床意義。如急性炎症時，可見a1，a2區百分率升高；腎病綜合征、慢性腎小球腎炎時呈現白蛋白下降，a2球蛋白升高，β球蛋白也升高；缺鐵性貧血時可由於轉鐵蛋白的升高而呈現β區帶增高，醫|學教育網搜集整理而慢性肝病或肝硬變呈現白蛋白顯著降低，r球蛋白升高2-3倍，示免疫球蛋白多克隆增高，甚至可見β-r融合的橋連現象，還可在r區呈現細而密的寡克隆區帶；對單一克隆漿細胞異常增殖所產生的無抗體活性均一的免疫球蛋白稱M蛋白的檢測，血清蛋白電泳是其首選的實驗診斷方法。可在電泳區帶的a2-r區呈現緻密而深染，高度集中的蛋白克隆增生區帶，稱其為m蛋白區帶，掃描後形成高而狹窄的單株峰，若些峰在r區其峰高與峰底寬之比>2：1，而由於正常免疫球蛋白合成限製造成背景染色淺。由M蛋白所導致的一組疾病如：多發性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重鏈病、游離輕鏈病、半分子病、良性單株丙球血症和雙M蛋白血症等，目前這類疾病已不屬罕見。血清蛋白電泳對這類疾病的早期診斷，療效觀察和預後判斷均有十分重要的意義。

二、電泳技術與免疫技術相結合，大大擴大了其臨床應用的范圍

讓電流來加速抗原與抗體的擴散並規定其運行方向、從而加快了沉澱反應速度。免疫電泳技術的種子類很多，如：對流免疫電泳（CIEP）、火箭免疫電泳（RIE）、電免疫擴散（EID）。在種免疫電泳方法牟基礎上，又不斷地派生出一些新的技術，如：免疫電泳（IEP）技術，1969年Alper與Johnson推薦免疫固定電泳（IFE）是一種包括瓊脂糖凝膠蛋白電泳和免疫沉澱兩個過程的操作，是免疫沉澱反應的一種混合技術，檢測標本可以是血清、尿、腦脊液或其他體液。1976年血清免疫固定電泳（IF）技術再次被推薦，用於M蛋白的分型。血清蛋白質在瓊脂糖凝介質上經電泳分離後，應用固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清，加於凝膠表面的泳道上，經孵育讓固定劑和抗血清的在凝膠內滲透並擴散後，若有對應的原存在，則在適當位置形成抗原抗體復合物。經染色後蛋白質電泳參考泳道和抗原抗體沉澱區帶被氨基黑著色，根據電泳移動距離分離出單克隆組分，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型。該技術的最大優勢是敏感性達50-150mg/dl，操作周期短，僅需數小時，解析度高，結果易於分析。現最常用於M蛋白的分型與鑒定，已列入臨床實驗室的常規檢測工作。

三、電泳技術進行同工酶譜分析，提高診斷率

1、血清乳酸脫氫酶同工酶（iso-LDH）：測定LDH同工酶有電泳法、離子交換柱層析法、免疫法、抑制劑法和酶切法，但迄今用得取多的仍是瓊脂糖凝膠電泳法。經電泳分離後要分離出五種同工酶區帶，急性必肌梗塞發病後平均6hLDH1即開始升高，LDH1/LDH2≥1為心肌損傷的陽性決定性水平，肝癌時可見LDH5明顯升高，各區帶含量的確定，將經電泳分離後的同工酶譜採用掃描予以定量，其精確度明顯高於用肉眼判斷。

2、血清肌酸激酶同工酶（ISO-CK）；測定CK和CH-MB仍是目前用於證實急性心肌梗塞的道選指標。近年來國內一些單位用免疫抑製法測CK=MB，其原理為抗M亞單位的酶活性，因為正常血清中幾乎無CK=BB，故將此值乘以2可以認為大致代表CK-MB的活性。此法簡單迅速，缺點是特異性差，如患者血清中存在CK-BB或者異常CK時，都將出現假性增高。不少作者報道異常CD-同工酶，一條稱巨CK（Maxro-CK），它是CK-BB與免疫球蛋白的復合物，有IgG亦有IgA，在正常血清中Marco-CK僅佔0.8%-1.6%.另一條稱線粒體CK（CK-MT），CK-MT是結合在肌肉、腦、肝內的線粒體表面，可能是線粒體膜的碎片，在正常血清中CK-MT是不出現的，在心梗時亦不出現，只有當組織極度損傷，由於線粒體和細胞壁極度破壞，方可在血清中檢出。由於Macro-CK和不典型的CK-MT均不能被M抗體所抑制，故當它們出現時，會導致CK-MB高於CK總活力的假性升高。使用電泳方法分離CK-MB，是根據CK-同工酶分子結構不同，醫|學教育網搜集整理在電泳緩沖液中，所帶電荷各異，可以從陰極到陽極將CK不同組份予以分離，其分別為CK-MM，CK-MB和CK-BB.電泳特點是當出現異常2同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，從電泳圖譜上很容易發現，由掃描儀對各條酶進行掃描，報告各條區帶所佔百分比，結合總酶活力，求得區帶的酶省略定值結果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中間，而CK-MT位置靠近陰極端，在CK-MM後面。這樣不會將CK-BB和各種異常同工酶誤認為是CK-MB而誤診，也可解決CK-MB假性增高的錯誤原因所在。為此，CK同工酶電泳是項非常實用的檢驗技術，具有十分重要的臨床意義。

3、CK亞型同工酶：此外，CK-MB和CK-MM亞型測定常採用瓊脂糖凝膠等電聚焦電泳或高壓電泳，由於操作比一般電泳麻煩，故常規常測定尚無法普及。目前引進的自動電泳儀，有試劑盒提供，可作CK亞型分析，參考值：CK-MM1（57.7±4.7）%；CK-MM2為（26.5±5.3）；CK-MM3為（15.8±2.5）%；CK-MM3/CK-MM1比值為0.28±0.05（范圍0.15-0.39），陽性決定性水平>0.5.AMI第一天血中以MM3為主，但第二天以後則以MM1為主。採用電泳法分離CKMB，CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2極微，一般比值近似是而非，在急性心肌梗塞後4-6hCKMB2亞型即在血循環中可被檢測到，故MB2/MB1的比例明顯升高，並早於總CK-MB片段的增高。當心肌梗塞緩解後此比便也逐漸下降。也可用於溶栓治療後的病情觀察。

四、結合酶免疫標記抗體技術，檢測腦脊液內寡克隆區帶

曾有作者報道採用二維電泳和銀染進行CSF蛋白質的分離與鑒定，方法繁復，耗時，現採用高解析度瓊脂糖凝膠電泳分離CSF中的蛋白質，並經抗原和辣根過氧化物酶標記的特異性IgG抗體進行反應來鑒定「寡克隆區帶」（OCB），經此酶免疫標記放大技術和顯色步驟，蛋白質濃度達31-125ul/L即可予以檢測，可使檢測靈敏度提高了100倍，這樣腦脊液無須濃縮，避免了在濃縮過程中蛋白質的丟失。可用於證實和分辨OCB免疫球蛋白及其型別。若在腦脊液標本中檢出OCB，而其相應標本中未能檢出區帶，則為陽性，真實地反映是由中樞神經系統本身合成的免疫球蛋白，具有重要臨床意義。它是一種定性檢測，在多發性硬化症時，OCB是一個十分重要的標志物。但須將患者血清和CSF在同一天同步進行分析，以認證不同來源的免疫球蛋白。中樞合成免疫球蛋白是中樞神經系統疾患的一個重要信號，主要用於診斷的鑒別診斷中樞神經系統疾患如：多發性硬化症、痴呆、脊髓炎、付腫瘤性腦炎、神經性梅素等。

五、利用固相內抗原、抗體反應分離脂蛋白（a），用於心、腦知管獨立的危險因子的檢測

該技術是利用抗原、抗體反應將電泳分離的脂蛋白予以鑒別。血清經瓊脂糖凝膠電泳，再經染色後可出現不同脂蛋白的條帶。由於凝膠中脂蛋白等電點不同，不僅可區分a、前β和β區帶，又因介質中含有抗脂蛋白（a）【LP（a）】抗體及陽離子存在，抗LP（a）與患者血清中LP（a）結合形成復合物，陽離子則抑制其他脂蛋白的泳動速度，LP（a）便與其他脂蛋白分離開來，使分辨十分清晰的LP（a）條帶呈現在前β與γ區域之間，將陽性條帶掃描後，可獲得區帶的面積及其百分含量，該方法使電泳技術趨於完美，大大減少了手工操作的弊端，既可予以半定量，又能將膠片保存，便於比較。提高對心、腦血管獨立的危險因子——LP（a）檢測的敏感性和特異性。

六、按分子量大小進行非濃縮尿蛋白電泳，區分尿蛋白類型

尿蛋白電泳可將尿液中各種蛋白質分離用於區分尿蛋白類型，可在無操作的情況下，協助臨床判斷腎臟損傷的部位。國內部分實驗室採用SDS-PAGE盤狀電泳進行尿蛋白分離，該法具有局限性，耗時，操作繁瑣，標本要求高，尿液需預濃縮，不適於臨床實驗室廣泛開展。SDS=AGE電泳不需預濃縮，尿蛋白電泳後呈現出中、高分子量蛋白區，帶主要反應腎小球病變；呈現出低分子量蛋白區帶，可見於腎小管病變及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿則可見到大、中、小各種分子量區帶，示腎小球及腎小管均受累及。掃描儀可對電泳後尿液中蛋白質剖象進行掃描，求出百分比，以顯示腎小球或腎小管損傷程度，其電泳圖譜及掃描圖形可作國資料永載，利於分析比較。醫|學教育網搜集整理該技術的最大進步是尿液不需預濃縮，操作簡便，結果清晰，僅需三小時即可完成試驗，還備有完整的定性標准，易於量化，便於分析，對腎臟疾的診斷，鑒別診斷，指導治療和判斷癒合頗有價值。

近期發展起來的毛細管電泳是一種新型的區帶電泳，又稱毛細管帶電泳。它是在毛細管中裝入緩沖液，在其一端注入樣品，在毛細管兩端加直流高電壓實現對樣品的分離，他離後的樣品依次通過設在毛細管一端的檢測器檢出。毛細管電泳在檢驗醫學中的應用也十分廣泛，從所檢測樣品的來源看可分為尿樣、血漿、血清、腦脊液、紅細胞、其他體液或組織，以及實驗動物活體等。從分離對象看包括蛋白質、多肽、氨基酸、糖、酶、DNA、寡核苷酸、病毒、小和生物活性分子、離子、葯物及其代謝產物等。根據用途可分為臨床疾病診斷、臨床蛋白質分析、臨床葯物分析、代謝研究、病理研究、同工酶分析、PCR產物分析、DNA片段及序列分析等。由於它具有無法比擬的高效和快速性，因而受到越來越多科學家們的重視。

中國的電泳技術起步不算太晚，但由於種種原因，大多數實驗室仍採用較落後的電泳設備。隨著國際、國內科技發展的日新月異和檢驗醫學發展的突飛猛進，電泳技術也在不斷發展和更新，其在臨床醫學和分子生物學領域中有著極其廣泛的應用價值，相信隨著該技術的不斷發展必將越來越受到同道們的青睞。

㈡ 什麼是SRAP標記技術其原理是什麼有哪些應用領域

the optimization of Srap tec-system and the application on analysis of genetic diversity of Chinese alligator
摘 要：基於PCR的分子標記技術很多，但均因自身缺點限制了發展和應用。
abstract：There're various technologies on PRC-molecular marker，whose development are all restrained by their inherited shortage.
一種新興的分子標記技術－相關序列擴增多態性SRAP以其特有的優點得到日益廣泛的應用，顯示了良好的發展前景。as it ows a sui genetic advantage,a new burgeoning molecular marker tecnologe --相關序列擴增多態性SRAP is widely applied. 此技術目前較多應用於植物材料的遺傳分析，本研究將通過對技術體系各影響因素進行調整，優化反應體系，比較DNA提取方法，調整銀染技術，得到很好的擴增效果。this teconology is used to applied to anlynasis the heredity of plant-material.Our research will modify the effective aspects to optimize the reaction system and modify the 同時對SRAP的原理、特點及其對浙江長興揚子鱷種群遺傳多樣性的分析進行了介紹。研究結果表明，SRAP同樣可以用於動物遺傳多樣性分析，為其保護提供分子支持。SRAP技術將成為研究領域一個有力的工具。暈 好累 幹活晚點繼續

㈢ SSR 分子標記技術的實驗過程

1）找個公司合成引物
2）提取DNA
3）PCR擴增
4）電泳檢測，不要用瓊脂糖，要用丙烯醯胺凝膠，變性非變性均可，大板小板都行，但大板效果更好點，小板做起來比大板省點事。
5）顯影，一般用銀染，NaON和碳酸鈉均可。
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下面給你粘一點我論文里的步驟：

1.2. SSR引物
本研究SSR位點及其引物序列來自2011年發布的煙草高密度SSR遺傳連鎖圖譜，在圖譜中24個連鎖群上按照間隔3~5cM的距離選取了位點並合成引物，共合成SSR引物697對，用於CMV標記篩選和遺傳定位。
1.3. DNA提取
採用天根™ DNA提取試劑盒提取供試材料全基因組DNA。
1.4. PCR反應體系
PCR總反應體系為10µL，其中30~50 ng/µL DNA 模板1 µL，2×Mix 5µL，2µmol/L正反向引物混合工作液1µL，加ddH2O至10µL。所用試劑購自MBI。
PCR反應在96孔ABI Veriti梯度基因擴增儀上按以下程序運行：首先94°C預變性5min； 94°C 15s，55°C 15s，72°C 30s 32個循環；最後72°C延伸7min，4°C保存。
1.5. 電泳檢測
完成PCR循環48h內，取2µL PCR產物在8%非變性聚丙烯醯胺凝膠上恆電壓850v電泳90min。用稍加改進的NaOH銀染方法對電泳後的聚丙烯醯胺凝膠進行染色顯影。各種溶劑的配方和體積為：銀染液，0.1%AgNO3溶液1L；顯影液，16g NaOH，8mL 37%甲醛，加去離子水定容到1L；終止液，0.75%Na2CO3溶液1L。銀染程序為：（1）去離子水沖洗15s；（2）銀染8min；（3）去離子水沖洗15s；（4）在顯影液中輕搖至顯帶；（5）放入終止液，終止顯影。顯影完成之後，將聚丙烯醯胺凝膠放置在陰涼通風處3~4h，待完全乾燥後，在透射式看片機上用數碼相機採集圖像。

㈣ 端粒酶療法發明人是誰

端粒酶療法:是以抑制或激活端粒酶活性為手段的基因療法。主要是用反專義核酸或核(ribozyme) 技術，抑制屬端粒酶在抗癌方面;激活端粒酶在延緩人類體細胞衰老方面的應用。

端粒酶，又稱端聚酶。端粒酶是一種自帶RNA 引物的逆轉錄酶。生殖細胞、造血幹細胞和腫瘤細胞含有較高的端粒酶活性。其活性可用聚合酶鏈反應(PCR) 技術擴增其酶促反應產物(即TRAP 法) ，然後輔以銀染法測定之。端粒酶的存在使染色體末端得以完全復制。染色體端區(telomere) ，又稱端粒。端區消失可能是人類細胞喪失復制能力的原因之一。端區是真核生物染色體末端的特殊結構。人類染色體末端普遍存在端區結構。人類染色體端區由進化上高度保守的DNA 重復序列TTAGGG組成，由端粒酶合成。

端粒酶療法，主要是用反義核酸或核酶(ribozyme) 技術抑制端粒酶活性，誘導惡性細胞分化與凋亡;激活端粒酶在延緩人類體細胞衰老等方面各有應用價值。端粒酶療法在醫學中極為重要，目前，是國內外醫學界研究熱點。端粒酶療法對腫瘤防治、診斷和延緩人類體細胞衰老等方面具有重要意義。

㈤ DNA銀染方法的優化

DNA銀染檢測方法的改進
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【英文篇名】 Improvement of DNA Silver Staining Detection
【作者中文名】 李天翊; 張運峰; 范永山;
【作者英文名】 LI Tian-yi; ZHANG Yun-feng; FAN Yong-shan（Department of Life Science; Tangshan Teachers College; Tangshan Hebei 063000; China）;
【作者單位】 唐山師范學院生命科學系;
【文獻出處】 唐山師范學院學報, Journal of Tangshan Teachers College, 編輯部郵箱 2009年 05期
期刊榮譽：ASPT來源刊 CJFD收錄刊
【關鍵詞】 PAGE; 銀染; DNA檢測; 影響因素;
【英文關鍵詞】 PAGE; silver staining; DNA detection; influencing factors;
【摘要】 DNA的聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測技術是分子生物學實驗中的一個難點。對點樣量、固定時間、顯色時間等因素進行了改進和優化,收到了較好的實驗效果。
【英文摘要】 Silver staining for DNA polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) is one important but difficult technique in Molecular Biology.The influencing factors,inculding the quantity of sample application,stationary time,and imaging time,were optimized for the PAGE/silver staining technique.The good experimental results showed that the improved method was feasible and available.
【DOI】 CNKI:SUN:TSSF.0.2009-05-022

㈥ 蛋白質組組學研究的基本策略是什麼

蛋白質組 蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組(genOME)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(PROTein). 蛋白質組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環境狀態的不同而改變. 在轉錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，並且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯後的修飾. 故一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目有時可以超過基因組的數目. 蛋白質組學(Proteomics)處於早期「發育」狀態，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩定的知識體系，而是一個領域. 蛋白質組學集中於動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，鑒定疾病、葯物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調控的機制. 作為一門科學，蛋白質組研究並非從零開始，它是已有20多年歷史的蛋白質(多肽)譜和基因產物圖譜技術的一種延伸. 多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產物圖譜依靠多種分離後的分析，如質譜技術、氨基酸組分分析等.
[編輯本段]蛋白質組學的研究內容
主要有兩方面，一是結構蛋白質組學，二是功能蛋白質組學。其研究前沿大致分為三個方面：
① 針對有關基因組或轉錄組資料庫的生物體或組織細胞，建立其蛋白質組或亞蛋白質組及其蛋白質組連鎖群，即組成性蛋白質組學。
② 以重要生命過程或人類重大疾病為對象，進行重要生理病理體系或過程的局部蛋白質組或比較蛋白質組學。
③ 通過多種先進技術研究蛋白質之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白，即相互作用蛋白質組學，又稱為「細胞圖譜」蛋白質組學。
此外，隨著蛋白質組學研究的深入，又出現了一些新的研究方向，如亞細胞蛋白質組學、定量蛋白質組學等。
[編輯本段]蛋白質組學研究中的主要技術
1 雙向凝膠電泳技術(2-DE)
雙向凝膠電泳技術與質譜技術是目前應用最為廣泛的研究蛋白質組學的方法。雙向凝膠電泳技術利用蛋白質的等電點和分子量差別將各種蛋白質區分開來。雖然二維凝膠電泳難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、解析度和重復性好以及可與質譜聯用的特點，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質組研究手段。雙向凝膠電泳技術及質譜基礎的蛋白質組學研究程序為樣品制備→等電聚焦→聚丙烯醯胺凝膠電泳→凝膠染色→挖取感興趣的蛋白質點→膠內酶切→質譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用資料庫確定蛋白。蛋白質組研究要求有高解析度的蛋白質分離及准確、靈敏的質譜鑒定技術。凝膠電泳中蛋白質的著色不僅影響蛋白質分離的解析度，同時也影響後續的質譜鑒定。蛋白質的染色可分為有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色四類。
Unlu 等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白質組學分析方法。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE 在技術上的改進，結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒游標記的樣品，並第一次引入了內標的概念。兩種樣品中的蛋白質採用不同的熒游標記後混合，進行2-DE，用來檢測蛋白質在兩種樣品中表達情況，極大地提高了結果的准確性、可靠性和可重復性。在DIGE技術中，每個蛋白點都有它自己的內標，並且軟體可全自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE 技術已經在各種樣品中得到應用。
2 高效液相色譜技術(HPLC)
盡管二維凝膠電泳（2-DE）是目前常用的對全蛋白組的分析方法，但其存在分離能力有限、存在歧視效應、操作程序復雜等缺陷。對於分析動態范圍大、低豐度以及疏水性蛋白質的研究往往很難得到滿意的結果。Chong 等使用HPLC/ 質譜比較分析惡性腫瘤前和癌症兩種蛋白質差異表達。利用HPLC 分離蛋白質，並用MALDI-TOF-MS 鑒定收集的組分，從而在兩種細胞中的差異表達中對蛋白質進行定量分析。多維液相色譜作為一種新型分離技術，不存在相對分子質量和等電點的限制，通過不同模式的組合，消除了二維凝膠電泳的歧視效應，具有峰容量高、便於自動化等特點。二維離子交換- 反相色譜(2D-IEC-RPLC)是蛋白質組學研究中最常用的多維液相色譜分離系統。
3 表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜(SEL-DI)技術
表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜技術於2002 年由諾貝爾化學獎得主田中發明，剛剛產生便引起學術界的高度重視。SELDI 技術是目前蛋白質組學研究中比較理想的技術平台，其全稱是表面增強激光解吸電離飛行時間質譜技術(SELDI-tof)。其方法主要如下：通常情況下將樣品經過簡單的預處理後直接滴加到表面經過特殊修飾的晶元上，既可比較兩個樣品之間的差異蛋白，也可獲得樣品的蛋白質總覽。因此，在應用方面具有顯著優勢。SELDI 技術分析的樣品不需用液相色譜或氣相色譜預先純化，因此可用於分析復雜的生物樣品。SELDI 技術可以分析疏水性蛋白質，PI 過高或過低的蛋白質以及低分子質量的蛋白質( < 25 000) ，還可以發現在未經處理的樣品中許多被掩蓋的低濃度蛋白質，增加發現生物標志物的機會。SELDI 技術只需少量樣品，在較短時間內就可以得到結果，且試驗重復性好，適合臨床診斷及大規模篩選與疾病相關的生物標志物，特別是它可直接檢測不經處理的尿液、血液、腦脊液、關節腔滑液、支氣管洗出液、細胞裂解液和各種分泌物等， 從而可檢測到樣品中目標蛋白質的分子量、PI、糖基化位點、磷酸化位點等參數。
4 同位素標記親和標簽(ICAT)技術
同位素親和標簽技術是近年發展起來的一種用於蛋白質分離分析技術，此技術目前是蛋白質組研究技術中的核心技術之一。該技術用具有不同質量的同位素親和標簽( ICATs) 標記處於不同狀態下的細胞中的半胱氨酸，利用串聯質譜技術，對混合的樣品進行質譜分析。來自兩個樣品中的同一類蛋白質會形成易於辨識比較的兩個不同的峰形，能非常准確的比較出兩份樣品蛋白質表達水平的不同。ICAT 的好處在於它可以對混合樣品直接測試；能夠快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質，尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；還可以快速找出重要功能蛋白質。
由於採用了一種全新的ICAT 試劑，同時結合了液相色譜和串聯質譜，因此不但明顯彌補了雙向電泳技術的不足，同時還使高通量、自動化蛋白質組分析更趨簡單、准確和快速，代表著蛋白質組分析技術的主要發展方向。針對磷酸化蛋白分析以及與固相技術相結合ICAT 技術本身又取得了許多有意義的進展，已形成ICA T 系列技術。用具有不同質量的同位素親和標簽( ICATs) 標記處於不同狀態下的細胞中的半胱氨酸，利用串聯質譜技術，可對混合的樣品進行質譜分析。
5 生物信息學
近年來，生物信息學在生命科學研究中起著越來越重要的作用。利用生物信息學對蛋白質組的各種數據進行處理和分析，也是蛋白質組研究的重要內容。生物信息學是蛋白質組學研究中不可缺少的一部分。生物信息學的發展，已不僅是單純的對基因組、蛋白質組數據的分析，而且可以對已知的或新的基因產物進行全面分析。在蛋白質組資料庫中儲存了有機體、組織或細胞所表達的全部蛋白質信息，通過用滑鼠點擊雙向凝膠電泳圖譜上的蛋白質點就可獲得
如蛋白質鑒定結果、蛋白質的亞細胞定位、蛋白質在不同條件下的表達水平等信息。目前應用最普遍的資料庫是NRDB 和dbEST 資料庫。NRDB 由SWISS2PROT 和GENPETP 等幾個資料庫組成，dbEST是由美國國家生物技術信息中心（NCBI）和 歐洲生物信息學研究所(EBI)共同編輯的核酸資料庫；計算機分析軟體主要有蛋白質雙向電泳圖譜分析軟體、蛋白質鑒定軟體、蛋白質結構和功能預測軟體等。

㈦ 急求！！DNA測序的問題

DNA測序技術
DNA sequencing technology
在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，產生 A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。
Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、 A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X- 光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

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一、概述：
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對於放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成後經90分鍾就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。
Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對於雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的准確性，能產生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始於每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對於有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
由於本系統採用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03-- 2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的鹼變性及乙醇沉澱過程，變性循環也有助於消除由於線性dsDNA模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
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二、材料
待測已提純的DNA，可為單鏈，也可為雙鏈。
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三、設備
高壓電泳儀，測序用電泳槽，制膠設備，PCR儀。
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四、試劑
（1）SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。
（2）丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺儲備液（38%丙烯醯胺 W/V，2%甲叉雙丙烯醯胺 W/V)：95g丙烯醯胺，5g甲叉雙丙烯醯胺溶於140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm過濾器過濾後，貯於棕色瓶中，置於4℃冰箱可保存2周。
（3）10%過硫酸銨，0.5g過硫酸銨溶於4ml水中，定容至5ml，應新配新用。
（4）10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶於雙蒸水中定容至1升，置於4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。
（5）TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配製2升備用。
（8）染色溶液：硝酸銀2克，甲醛3ml，溶於2升超純水中備用。
（9）顯影溶液：60克碳酸鈉（Na2CO3)溶於2升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸鈉溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
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五、操作步驟
：
成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用推薦的DNA模板量, 每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，並且注意如下幾點：
（1） DNA的濃度和純度必須經過瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測定, 樣品應與已知量DNA一起電泳。
（2） 分光光度法對於很多DNA提取物包括質粒小量制備來說，並不能給出一個可信的DNA濃度估計，混雜的染色體DNA、蛋白、RNA、有機物及無機化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常錯誤地高估DNA濃度。
（3） DNA制備過程中用核糖核酸酶處理所產生核糖核苷酸，雖然它們在電泳後DNA樣品的前面，並不能觀察到，但它們仍會有260nm光吸收。
（一）測序反應：
1. 對於每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存於冰上或4℃備用。
2. 對於每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA 2.1pmol
5×測序緩沖液 5ml
引物 4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg) 4.0ml
5×測序緩沖液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
無菌ddH2 O 至終體積 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位於eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對於每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350鹼基的長度。
7. 熱循環程序完成後，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
[注意] 1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板種類/長度 模板量
200bp (PCR產物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋質粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由於超螺旋質粒產生的信號比鬆弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
2、計算與4.5pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物鹼基數
計算與1pmol相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板鹼基對數
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板鹼基數
3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
模式1：適用於引物<24鹼基或GC含量<50%
95℃ 2分鍾。然後： 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鍾(延伸)。
模式2:適用於≥24鹼基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鍾, 然後: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入終止溶液之後樣品可在4℃保存過夜。
（二）、 測序凝膠板的制備
1、玻璃板的處理：
銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最後用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯於玻璃板上。這一步對於在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
（1）短玻璃板的處理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。
B. 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過並已經自然乾燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。
C. 4-5分鍾後, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然後略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多餘的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。
2. 准備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的, 否則將導致凝膠撕裂。
(2)、長玻璃板的處理
A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。
B. 5-10分鍾後用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多餘的Sigmacote溶液。
[注意] 1. 用過的凝膠可在水中浸泡後用剃須刀片或塑料刮刀颳去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10% NaOH浸泡後除去。為防止交叉污染, 用於清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開, 如果出現交叉污染, 以後制備的凝膠可能撕裂或變得鬆弛。
2、凝膠的制備：
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理後，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置於玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓於其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結果。配製過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2ml，並用0.45mm的濾膜過濾，然後加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻後，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制後4-6分鍾，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的 TEMED和過硫酸銨。
凝膠終濃度
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE緩沖液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
雙蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%過硫酸銨(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
(3)膠配製好後，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完後，靜止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。
2、灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。
（三）電泳：
1、預電泳
（1）當凝膠聚合完全後，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。
（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板後，方能加入TBE緩沖液。
（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產生的氣泡，接上電源准備預電泳。
（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應先將水浴加熱至55℃後進行預電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。
（5）按30V/cm的電壓預電泳20-30分鍾。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區形成的發夾狀結構，影響測序的結果。
[注意]
（1）. 用鯊魚齒梳製作加樣孔時，應注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結果。
（2）. 應時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。
2、樣品的制備：
當在預電泳時，即可進行樣品的制備，將反應完畢的樣品在沸水浴中加熱1-3分鍾，立即置於冰上即可。如果樣品長時間不用，則應重新處理。可使用4- 6%聚丙烯醯胺凝膠，膠厚0.4mm。厚度小於0.4mm的膠可能導致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。
3、上樣及電泳
關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然後立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、 T、C。加樣完畢後，立即電泳。開始可用30V/cm進行電泳，5分鍾後可提高至40-60V/cm，並保持恆壓狀態。一般來說，一個55cm長， 0.2mm厚的凝膠板，在2500V恆壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長的序列，可採用兩輪或多輪上樣。
[注意]
1、上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應等溫度達到後才能上樣電泳。
2、一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的解析度降低，並且使帶擴散。電泳中可進行恆功率電泳。
（四）、 測序凝膠的銀染
染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。
1. 電泳完畢後用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。
2. 固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒,充分振盪20分鍾或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜(不振盪)。保留固定/停止溶液，用於終止顯影反應。
3. 洗膠：用超純水振盪洗膠3次，每次2分鍾。從水中取出, 當轉移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10-20秒，使水流盡。
4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鍾。
5. 凝膠顯影：
(1). 在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400μl)以完成顯影液的配製。
(2). 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注意，把凝膠從超純水轉移到顯影溶液的總時間不能長於5-10秒。浸泡時間過長則導致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長,可重復第五步用染色液浸泡。
(3). 立刻將凝膠轉移至1升(總量的一半)預冷的顯影液充分振盪直至模板帶開始顯現或開始出現第一批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續顯影2--3分鍾,或直至所有條帶出現。
6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應,固定凝膠。
7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鍾，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。
8. 將凝膠置於室溫乾燥或用抽氣加熱法乾燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實驗結果。
[注意] 測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗受幾個因素的影響。
1. 水的質量對於染色的成功極其重要。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得較好的效果, 如果水中有雜質, 則低分子量條帶可能無法出現。
2. 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可獲得較好的結果。
3. 染色後的洗滌步驟是非常關鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA, 產生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進行。
4. 如果凝膠厚度超過0.4mm或丙烯醯胺濃度高於4-6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比0.4mm薄，染色反應後的洗滌必須縮短至不超過5秒。
5. 在室溫下進行所有步驟，顯影反應除外。顯影溶液必須預冷至10-12℃以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復使用任何溶液。