引物設計原理

A. 簡述引物設計的基本原則

1.PCR技術基本原理：PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 2.PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。 3.PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。 4.PCR的特點：特異性強。對標本的純度要求低。靈敏度高。 5.PCR反應的特異性決定因素為： ①引物與模板DNA特異正確的結合； ②鹼基配對原則； ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性； ④靶基因的特異性與保守性。

B. 引物設計的引物設計原則

1、長度：15—30bp，其來有效長度[Ln=2(G十源C)十(A十T)]一般不大於38，否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產物的特異性。
2、G十c含量：應在40%一60%之間，PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5—10度。引物長度小於20時，其Tm恆等於4×(G十C)十2×(A十T)。
3、鹼基分布的隨機性：應避免連續出現4個以上的單一鹼基。尤其是不應在其3』端出現超過3個的連續G或C，否則會使引物在G十C富集序列區錯誤引發。
4、引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成發夾樣二級結構。
5、引物之間：兩個引物之間不應有多於4個的互補或同源鹼基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3』端的互補重疊。
6、上下游引物的互補性：一個引物的3『末端序列不允許結合到另一個引物的任何位點上。
7、3』末端：如果可能的話，每個引物的3『末端鹼基應為G或C。
8、引物應當超出限制性內切酶識別位點至少3個核苷酸。

C. 引物設計原理的設計流程

先進行序列下載，然後進行 同源性比較 ，最後進行引物設計篩選 。

D. 熒光定量pcr引物設計原理

如果你測定的基因序列未知，可以用同源基因或者別的物種的同類基因序列來設計引物，進行pcr，看看是否能夠擴增出產物，並對產物進行確認，判斷擴增的特異性。
如果確認無誤，就可以進行熒光定量pcr。

E. 簡並引物是什麼設計的原則或原理是什麼

利用NCBI搜索不同物種中同一目的基因的蛋白質或cDNA編碼的氨基酸序列 因為密碼回子的關系，不同是指代表編碼答單個氨基酸所有不同鹼基可能性的不同序列的混合物。密碼子具有簡並性，單以氨基酸順序推測編碼的DNA序列是不精確的，但可以設計成對簡並引物，擴增所有編碼已知順序的核酸序列。用簡並引物時寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數量應相同。的核苷酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的

F. pcr的技術的主要步驟及pcr引物設計的一般原則有哪些

PCR的技術的主要步驟及PCR引物設計的一般原則分述如下：

PCR的技術的主要步驟：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

2、引物設計的基本原則

1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內部不應出現互補序列。

4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

5、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

6、引物3『端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

7、引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

(6)引物設計原理擴展閱讀

PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR是一種體外DNA 擴增技術，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴於DNA聚合酶的酶促合反應，將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性——低溫退火——引物延伸」三步反應的多次循環，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。

在環境檢測中，靶核酸序列往往存在於—個復雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低，對於探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用， 如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

第一代PCR就是常見的定性PCR技術，它採用普通PCR儀來對靶基因進行擴增，採用瓊脂糖凝膠電泳來對產物進行分析。第二代PCR就是熒光定量PCR技術（Real-Time PCR，qPCR），它通過在反應體系中加入能指示反應進程的熒光試劑來實時監測擴增產物的積累，藉助熒光曲線的Cq值來定量起始靶基因的濃度。

第三代PCR技術--數字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一種全新的對核酸進行檢測和定量的方法。它採用直接計數目標分子而不再依賴任何校準物或外標，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。

PCR晶元技術PCR儀器發展的趨勢之一變得更加微型化，PCR晶元就是在這種趨勢下誕生的。PCR晶元就是在微型的載體上進行PCR反應，是微型化的PCR儀。晶元PCR不僅節省了大量反應試劑因此降低了實驗成本，還有助於提高反應速度。

G. 反向PCR引物設計的原理怎樣設計反向pcr的引物謝謝！！急急

cdna是單鏈，做race分3『端和5』端兩種情況。同時真菌與細菌mrna有差別。因此，設計race引物是有學問的。根據你自己的情況，好好設計吧。祝好運！

H. 多重pcr引物設計的原理有哪些

• 1、多殺性巴氏桿菌的Km t 及toxA 基因 T +Pm具有Km t 及toxA 基因 T Pm具有Km t基因 PCR引物：

• P1: 5′- A TC CGC TA T TTA CCC A GT GG-3′ P2: 5′-GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC-3′ P3: 5′- CTT A GA TGA GCG ACA A GG-3′ P4: 5′- GAA TGC CAC ACC TCT A TA G-3′ 引物P1，P2檢測Pm,擴增片段為457bp; 引物P3，P3檢測T +Pm，擴增片段為864bp.

• 退火溫度56℃，時間30秒

• 2、禽多殺性巴氏桿菌基因序列（U51470） 引物：

• 上游引物：5』-TGC CAA AGT TGC CAA TAC TCC-3』 下游引物：5』-TCC CGT CCT CAT TTC TTG CG-3』

• 退火溫度45℃，時間1分鍾

• 3、豬巴氏桿菌

• 參考GenBank中豬巴氏桿菌序列設計引物

• 上游PAS1：5』-AgggCACgCAggCggACTTTTA-3』 上游PAS2：5』-ATCgACAgCgTTTACAgCgTggA-3』

• 退火溫度56.5℃，時間1分鍾

• 4、致病性嗜水氣單胞菌（ 嗜水氣單胞菌標准株Ah10501）

• 究針對GenBank 中登錄的致病性嗜水氣單胞菌的溶血素基因( hlyA ) 、氣溶素基因( aerA ) 以及為氣單胞菌屬所特有的內參照基因16S rRNA 保守區設計了3 對特異性引，非致病性分離株均未擴增出毒力基因hlyA 和aerA ,而致病性分離株則至少含有hlyA 基因

I. PCR的原理是什麼，它有什麼用途

PCR的原理是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

PCR最有價值的應用領域就是對感染疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。

在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

(9)引物設計原理擴展閱讀

標準的PCR過程分為三步：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

J. 簡並引物是什麼設計的原則或原理是什麼在線等，急！！！

http://ke..com/view/3796392.htm?fromTaglist
中文名稱：
簡並引物
英文名稱：
degenerate primer
定義：
獲得序列未完全清楚的核酸的一種引物設計方案，特內點容是所設計的引物序列某位置的核苷酸可以分別是兩個或兩個以上不同的鹼基，結果所合成的引物是該位置上不同序列的混合物。
應用學科：
生物化學與分子生物學（一級學科）；方法與技術（二級學科）