dnaman設計引物
兩個生物信息學很常用的軟體，可以網路下它們的說明書，裡面有比較詳細的講解。就是如果是純自學的話可能得費點力
B. 用DNAman分析引物時，Thermo Tm、Hybridization Tm、GC+AT Tm分別是什麼意思急！！！
The melting temperature of an oligonucleotide is
calculated with three methods:
1)Thermodynamic Tm:
The Tm is calculated using the nearest-neighbor
thermodynamic values method (Breslauer et al). This method is less accurate for
longer oligos. The formula for the Tm is
Tm=dH/(dS-Rln(Cd))-273.15+16.6*(log10(Cs))
Where dH is the enthalpy, dS is the
entropy, R is 1.987 cal K-1 mol-1, Cd is the
DNA concentration, and Cs is the salt concentration.
2)Hybridisation Tm:
This method is generally used for DNA or RNA
hybridization, especially in presence of high salt and formamide. It is more
accurate with longer oligos. The Tm is calculated using the following
formula:
for DNA:DNA hybridization:
Tm=81.5+16.6*(log10[Na+])+0.41*[%(G+C)]-0.63*(%Formamide)-500/L-1.5(%Mismatch)
for DNA:RNA hybridization:
Tm=79.8+18.5*(log10[Na+])+0.58*[%(G+C)]+11.8*[%(G+C)]2-0.5*(%Formamide)-820/L-1.5(%Mismatch);
for RNA:RNA hybridization:
Tm=79.8+18.5*(log10[Na+])+0.58*[%(G+C)]+11.8*[%(G+C)]2-0.35*(%Formamide)-820/L-1.5(%Mismatch);
* where L is the length (bases) of the
oligonucleotide.
3)GC+AT Tm: the estimated Tm is the sum of
the contribution of each base: 2° for A and T and 4°C for G and C.
There are several parameters involved in Tm
calculation.
DNA concentration is used only in
thermodynamic Tm. You may increase oligo DNA concentration in order to increase
Tm.
Salt concentration affects thermodynamic Tm
and hybridization Tm. In the [Na+][mM] box, you may type a suitable salt
concentration of your experiments. The value must be an integer greater than
0.
Hybridization type is required for
Hybridization Tm. In the DNA/RNA box, enter the hybridization type:
C. 如何使用DNAMAN去確定引物在基因序列上結合的位置
在創口上部菜單欄中找到有search 功能的按鍵，會彈出一個小文本框窗口，輸入你的內引物序列，然後讓容它尋找(search)。但是要注意引物有正義鏈與反義鏈輸入的區別。
不知道你的引物是普通的25個鹼基，還是30個鹼基以上的超長引物。後者引物可以用alignment(比對)試試。不過也要注意正義、反義鏈的輸入。
D. 有哪位學長學姐會用DNAMAN設計PCR引物啊，老師留的作業，看了幾天書完全不會
你拿著DNAMAN玩兩天，就什麼都會了，這個東西不當面教你，會費很多筆墨，大家都是自己拿著軟體鼓搗出來的，多練練吧。
E. 用DNAMan設計的引物，其中有一條為GAGAGGAAGGAGAAGAGAATGG，只含3種鹼基，沒有C，不知道這種引物可用嗎
挺好的，幫你測試了下
Primer 1
--------
Primer: GAGAGGAAGGAGAAGAGAATGG
Length: 22
%GC: 50.0
Tm: 58.5 deg C
1 礸 of primer: 143.378 pMole ends
Self-annealing: maximum score = 4
GAGAGGAAGGAGAAGAGAATGG
||
GGTAAGAGAAGAGGAAGGAGAG
3' end score = 1
GAGAGGAAGGAGAAGAGAATGG
:
GGTAAGAGAAGAGGAAGGAGAG
F. 如何用dnaman軟體設計引物及找到引物上的酶切位點
1）PCR 引物設計
首先，將目標 DNA 片段裝入 Channel,並激活 Channel。點擊主菜單欄中的 Primer 主菜
單，出現下
拉菜單，如下所示：
點擊 Design PCR Primers for DNA 命令，出現下列對話框： 參數說明如下：
Primer locations on target 引物定位
其中包括下列選項：
Proct size（擴增目的片段大小）
Sense primer (正向引物選擇區)
Antisense primer(反向引物選擇區)
Primer 引物特性包括 Length(引物長度)，Tm 值, GC 含量等參數；
Reject primer 引物過濾（將符合引物過濾條件的引物過濾掉）
包括下列選項：
3』dimer(可形成 3』端自我互補的鹼基數)
Hairpin stem(可形成發卡頸環結構的鹼基數)PolyN(多聚鹼基)
3』Uique(3』端嚴格配對鹼基數)
Primer-Primer(含義未知)
All matches(引物互補配對百分數)
Consentrations 濃度設定
Proct for hybridyzat（ion） PCR 產物用於 Southern Blot 探針雜交
點擊按鈕，出現下列對話框：
.選擇需要的選項，點擊按鈕，出現：
點擊按鈕，完成操作。
2）DNA 序列的限制性酶切位點分析
將待分析的序列裝入 Channel，點擊要分析的 Channel，然後通過 Restriction/Analysis
命令打開對
話框，如下所示：
參數說明如下：
Results 分析結果顯示
其中包括：
Show summary（顯示概要） Show sites on sequence（在結果中顯示酶切位點）
Draw restriction map（顯示限制性酶切圖）Draw restriction pattern（顯示限制性酶
切模式圖）
Ignore enzymes with more than（忽略大於某設定值的酶切位點）
Ignore enzymes with less than（忽略小於某設定值的酶切位點）
Target DNA （目標 DNA 特性）
circular（環型 DNA），dam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）
all DNA in Sequence Channel（選擇此項，在 Sequence Channel 中的所有序列將被
分析，如果
選擇了 Draw restriction pattern，那麼當所有的 channel 中共有兩條 DNA 時，則只能選擇兩個酶
分析，如果共有三個以上 DNA 時，則只能用一個酶分析。
選擇所需的項目，然後按提示操作點擊按扭，出現下列對話框：
參數說明如下：
Enzyme
代表（enzyme data file），點擊旁邊的下拉按鈕，出現兩個默認選項，restrict.enz 和
dnamane.enz，
如果添加過自製的酶列表，則附加顯示自製酶列表文件名。其中 restrict.enz 數據文件包
含 180 種
限制酶，dnamane.enz 數據文件包含 2524 種限制酶。選擇其中一個數據文件，相應的
酶在左邊的
顯示框中列出（按酶名稱字母表順序），滑鼠雙擊酶名稱，則對應的酶被選中，在右邊空白
框中列
出。要自製酶切列表，可以從左邊酶列表中雙擊滑鼠選擇多種酶（例如 puc18 multiple
cloning sites），
然後點擊按鈕出現下列對話框：
輸入要保存酶列表的文件名，點擊按鈕即可保存。自製酶列表可以方便分析特定的酶切
位點。
Cutter 酶切識別序列長度；End 酶切產生的末端，其中包括，Blunt（平頭末端），
5』Overhang
（5』突出粘性末端）,3』Overhang(3』突出粘性末端)，系統根據 cutter 和 end 的設定情
況,在左邊酶列表
中顯示符合條件的酶。最後，點擊按鈕執行操作。
G. PCR引物設計原則，要詳細的。Primer5.0與DNAMAN哪個更全面
PCR引物設計的11條黃金法則
1.引物最好在模板cDNA的保守區內設計。
DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。
2.引物長度一般在15~30鹼基之間。
引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應。
3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。
4.引物3′端要避開密碼子的第3位。
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡並，會影響擴增的特異性與效率。
5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。
引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3′端最好選擇T。
6. 鹼基要隨機分布。
引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。
7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。
8. 引物5′ 端和中間△G值應該相對較高，而3′ 端△G值較低。
△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間△G值相對較高，而3′ 端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA 聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟體進行分析）
9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。
引物的5′ 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。
引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。
10. 擴增產物的單鏈不能形成二級結構。
某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟體（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小於58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。
11. 引物應具有特異性。
引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
做Real Time時,用於SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求：
1)避免重復鹼基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端最後5個鹼基內不能有多於2個的G或C.
5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。
6)PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。
7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。
而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
至於設計軟體，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都應該可以的。
做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對於引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想准備---尋找合適的引物非常不容易。
關於BLAST的作用應該是通過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現並在GENEBANK中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那麼這個引物的特異性就很差，從而不能用。
H. 如何用dnaman軟體設計引物及找到引物上的酶切位點
1） 引物設計
首先，將目標 DNA 片段裝入 Channel,並激活 Channel。點擊主菜單欄中的 Primer 主菜
單，出現下
拉菜單，如下所示：
點擊 Design PCR Primers for DNA 命令，出現下列對話框： 參數說明如下：
Primer locations on target 引物定位
其中包括下列選項：
Proct size（擴增目的片段大小）
Sense primer (正向引物選擇區)
Antisense primer(反向引物選擇區)
Primer 引物特性包括 Length(引物長度)，Tm 值, GC 含量等參數；
Reject primer 引物過濾（將符合引物過濾條件的引物過濾掉）
包括下列選項：
3』dimer(可形成 3』端自我互補的鹼基數)
Hairpin stem(可形成發卡頸環結構的鹼基數)PolyN(多聚鹼基)
3』Uique(3』端嚴格配對鹼基數)
Primer-Primer(含義未知)
All matches(引物互補配對百分數)
Consentrations 濃度設定
Proct for hybridyzat（ion） PCR 產物用於 Southern Blot 探針雜交
點擊按鈕，出現下列對話框：
.選擇需要的選項，點擊按鈕，出現：
點擊按鈕，完成操作。
2）DNA 序列的限制性酶切位點分析
將待分析的序列裝入 Channel，點擊要分析的 Channel，然後通過 Restriction/Analysis
命令打開對
話框，如下所示：
參數說明如下：
Results 分析結果顯示
其中包括：
Show summary（顯示概要） Show sites on sequence（在結果中顯示酶切位點）
Draw restriction map（顯示限制性酶切圖）Draw restriction pattern（顯示限制性酶
切模式圖）
Ignore enzymes with more than（忽略大於某設定值的酶切位點）
Ignore enzymes with less than（忽略小於某設定值的酶切位點）
Target DNA （目標 DNA 特性）
circular（環型 DNA），dam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）
all DNA in Sequence Channel（選擇此項，在 Sequence Channel 中的所有序列將被
分析，如果
選擇了 Draw restriction pattern，那麼當所有的 channel 中共有兩條 DNA 時，則只能選擇兩個酶
分析，如果共有三個以上 DNA 時，則只能用一個酶分析。
選擇所需的項目，然後按提示操作點擊按扭，出現下列對話框：
參數說明如下：
Enzyme
代表（enzyme data file），點擊旁邊的下拉按鈕，出現兩個默認選項，restrict.enz 和
dnamane.enz，
如果添加過自製的酶列表，則附加顯示自製酶列表文件名。其中 restrict.enz 數據文件包
含 180 種
限制酶，dnamane.enz 數據文件包含 2524 種限制酶。選擇其中一個數據文件，相應的
酶在左邊的
顯示框中列出（按酶名稱字母表順序），滑鼠雙擊酶名稱，則對應的酶被選中，在右邊空白
框中列
出。要自製酶切列表，可以從左邊酶列表中雙擊滑鼠選擇多種酶（例如 puc18 multiple
cloning sites），
然後點擊按鈕出現下列對話框：
輸入要保存酶列表的文件名，點擊按鈕即可保存。自製酶列表可以方便分析特定的酶切
位點。
Cutter 酶切識別序列長度；End 酶切產生的末端，其中包括，Blunt（平頭末端），
5』Overhang
（5』突出粘性末端）,3』Overhang(3』突出粘性末端)，系統根據 cutter 和 end 的設定情
況,在左邊酶列表
中顯示符合條件的酶。最後，點擊按鈕執行操作。
I. 如何用DNAman 軟體設計引物
DNAMAN軟體可以設計引物嗎？建議用primer 5或者oligo 6
J. 如何利用dnaman設計簡並引物
在創口上部菜單欄中找到有search 功能的按鍵，會彈出一個小文本框窗口，輸入你的引物序內列，然後讓容它尋找(search)。但是要注意引物有正義鏈與反義鏈輸入的區別。 不知道你的引物是普通的25個鹼基，還是30個鹼基以上的超長引物。