多重pcr引物設計

A. 如何利用多重pcr擴增一條長片段

如何利用多重pcr擴增一條長片段
多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同專一PCR反應體系裡加上二屬對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同。一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用於單一致病因子等的鑒定。設計引物應遵循以下原則： ①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。 ②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 ③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。

B. 幾種PCR區別及引物問題求教

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Hot start PCR：
熱啟動 PCR，是提高 PCR 特異性和可信度的最好的方法之一。通過阻止溫度升高到變性溫度前的 PCR 反應的發生而阻止引物與基因組 DNA 上潛在的高同源性區域結合引起的錯誤引發（mispriming）。同時熱啟動還使引物通過互補區域鹼基配對而擴增產生的引物二聚體量大大降低。 熱啟動 PCR 可通過三種方式實現：
1) 手動熱啟動：配置反應液時忽略一種關鍵成分（聚合酶、Mg 離子或 dNTP），當反應液升溫到 80℃以上或變性溫度時再加入。手動熱啟動操作繁瑣，而且因為增加了一次開蓋操作，增加了污染的機會，同時由於管與管間的加樣誤差，可能使平行樣品間擴增結果產生差異；更簡單的手動熱啟動是在冰上配置反應液，待熱蓋升溫到變性溫度，按下擴增儀的暫停鍵，立即將反應管放在儀器上開始反應，當然這種方法的可信度也最低
2) 將聚合酶用石蠟珠包裹（或在反應液上部滴一滴融化的石蠟，待其凝固後，將聚合酶加到石蠟層的上部）使其與反應液的其它成分分開，直到反應液升溫融化石蠟後，酶才進入反應液中；
3) 使用熱啟動 DNA 聚合酶，這種酶通過化學修飾或與抗體結合，常溫下沒有活性，而只有當反應液加熱到變性溫度一段時間後，酶的活性才被釋放。使用熱啟動 DNA 聚合酶相比手動熱啟動操作簡便，缺點是用熱啟動 DNA 聚合酶的價格較高。
Touchdown PCR：
降落 PCR，是另一種簡單的降低非特異性擴增的方法，可規避對 PCR 循環條件進行耗時的優化實驗。降落 PCR 過程中，首輪循環的退火溫度設置在比引物的解鏈溫度高出幾度，使每個後續循環的退火溫度逐漸降到，直到退火溫度降到等於引物的解鏈溫度或比引物的解鏈溫度低幾度，後續的循環在此較低的退火溫度下完成，整個程序的退火溫度可降低 10-15℃。
在最初幾個循環內，高溫使引物的非特異性結合難以發生，只有同引物互補程度最大的模板序列（很可能這一序列就是我們感興趣的序列）才能發生退火事件，因此保證靶序列得到優先擴增。後續循環降低退火溫度可保證擴增效率，盡管最終的退火溫度降低到足以使非特異性產物有效擴增的溫度，由於靶分子已經開始指數期擴增，因此抑制非特異性產物的進一步形成。
Nested PCR：
巢式 PCR，通過使用兩套引物來進行兩次連續的反應，用來增加 DNA 擴增的特異性。在第一次反應中產生的產物可能包含非特異性擴增產物，然後使用兩個新的、結合位點位於原引物內部的引物進行第二次反應。第二套引物的使用可提高反應的特異性，增大單一產物產生的可能性。巢式 PCR 在提高特異性的同時，也增加了檢測的靈敏度。
Multiplex-PCR：
多重 PCR，指在一個 PCR 管中使用多對引物同時擴增超過一個的靶基因。同時分析單拷貝基因組的多個基因可避免分別擴增這些靶基造成對試劑和模板的浪費。使用多重 PCR 檢測引起遺傳疾病的基因突變時，可以同時擴增 6 個以上的靶點，也可同時檢測食品中多種病原菌的存在。在多重 PCR 基礎上發展的 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重連接探針擴增技術) 使用單對引物即可完成對多個靶基因的擴增，避免了多重 PCR 耗時的優化步驟。
Long PCR（Long distance PCR，Long range PCR）：
長距離 PCR，普通的 Taq 聚合酶一般只能擴增不超過 3-5kb 的片段，通過使用特定的聚合酶和緩沖液成分，來擴增較長的 DNA 鏈（10-40kb 以上）。長距離 PCR 時經常會在 10-15 個循環後，使每個循環的延伸時間都比上一循環的時間增加 10 秒左右，以補償聚合酶活性的損失。
Clony PCR：
菌落 PCR，通過 PCR 手段來迅速篩選陽性克隆子。使用滅菌的牙簽將菌落直接挑到反應混合液中，通過 PCR 預變性步驟的高溫使細菌的基因組釋放作為 PCR 反應的模板。菌落 PCR 中使用的引物定位在插入位點外側的載體區，因此盡管插入的序列各不相同，也不影響擴增反應的進行。
RT-PCR（Reverse Transcription PCR）：
逆轉錄 PCR，是用來擴增、分離和鑒定細胞或組織的信使 RNA（mRNA）的技術。反應由兩個階段組成：
1. 使用逆轉錄酶，通過逆轉錄反應「RT」合成與 RNA 互補的 cDNA（complementary DNA）
2. 使用 PCR 擴增特異性的 cDNA。
由於 PCR 的預變性步驟可以用來失活逆轉錄酶，所以兩個階段可在同一管內完成。一些 DNA 聚合酶如 Tth 也有 RT 活性，因此可以單獨使用這種酶來完成兩步反應。
RT-PCR 可廣泛用於表達圖譜分析（用來確定基因的表達）；鑒定 RNA 轉錄子的序列，當相關的基因序列已知時，還可進一步知道基因組上外顯子和內含子的位置；檢測病毒例如 HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。
RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends）：
一種 RT-PCR 方法，當對 DNA 序列信息了解較少時，使用單個特異性引物加一個接頭引物來擴增 cDNA 的 5'端（對應轉錄的起始位點）或 3' 端從而產生新的 cDNA，重疊的 RACE 產物可結合起來產生全長的 cDNA 片段。
DD-PCR (differential display)：
差異顯示技術，用來鑒定不同組織中差異表達的基因。將不同組織的 RT-PCR 產物用短的、非特異性引物進行擴增，然後在凝膠上比對來源於不同組織的條帶，只在某種組織中才出現的條帶被認為是差異表達的。
Asymmetric PCR：
不對稱 PCR，可選擇性的擴增出靶 DNA 的一條鏈，從而用於測序反應或制備單鏈雜交探針。反應中限制一個引物的加入量，隨著這一引物的用盡，後續的擴增中另一引物延伸的產物量大大過量。這一技術的關鍵是使用的限制引物的量要合適，引物量過多，則產物主要是雙鏈 DNA；引物量過少，在前幾輪循環就被耗盡，結果導致單鏈的產量減少。在不對稱 PCR 的基礎上發展出 Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR，線性指數 PCR)，使數量限制的引物比過量的引物的解鏈溫度更高，從而維持較高的反應效率。
Assembly PCR(也稱作 Polymerase Cycling Assembly 或 PCA)：
通過使用多個具有短重疊區的長的寡核苷酸來合成長的 DNA 鏈的方法。通過寡核苷酸產生一條條正向或反向 DNA 鏈，而寡核苷酸的重疊區則確定鏈組裝的順序，因此可有選擇性的產生最終的長鏈 DNA 分子。
Methylation-specific PCR (MSP)：
甲基化特異性的 PCR，用於研究基因組 CpG 島的甲基化模式。首先是用亞硫酸氫鈉處理靶 DNA，使未甲基化的胞嘧啶鹼基轉化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物識別成胸腺嘧啶，然後分別用能區分修飾和非修飾模板的不同的引物來擴增（一對可識別胞嘧啶引物擴增原來甲基化的模板，令一對可識別尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物擴增非甲基化的模板）。結合定量 PCR，可以對甲基化程度進行定量。
Ligation-mediated PCR：
連接介導 PCR，首先使用小的寡核苷酸接頭連接靶 DNA 片段，然後選擇與接頭結合的 PCR 引物來擴增未知的靶片段。這一技術主要用在 DNA 測序、染色體步移技術（genome walking）和 DNA 指紋圖譜等。
AFLP（Amplified fragment length polymorphism）：
擴增片段長度多態性，通過擴增使不同生物基因組呈現不同長度的片段。
AP-PCR (arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA)：
機擴增多態性 DNA，使用隨機寡核苷酸片段來擴增序列未知的靶基因，形成基因組指紋圖譜，用來分析物種的相關性。
Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR：
可變數目串聯重復序列 PCR，使引物定位在具有長度多態性的靶基因區，通過在凝膠電泳後對產物的大小進行分析來研究基因分型。
Allele-specific PCR：
等位基因特異性 PCR，設計引物時選擇在基因組的多態性區域，使等位基因的突變定位在（或接近）引物的 3' 端，在嚴謹的反應條件下，存在錯配鹼基的引物不能起始復制，而只有完全匹配的引物才能起始復制，產生的產物因此顯示不同的基因型。
InterSequence-Specific PCR(ISSR-PCR)：
一種 DNA 指紋圖譜技術，所選的引物定位在基因組的片段重復區（如 Alu 族），擴增後產生基於不同產物長度的唯一的指紋圖譜。
Inverse PCR：
反向 PCR，允許擴增已知序列側翼的 DNA 區。首先將靶 DNA 用限制性內切酶進行多輪消化，然後連接被消化的片段構建環狀的分子，引物設計成可從序列已知的區域向外側延伸，結果擴增出環狀分子上剩餘的序列。
Quantitative PCR(Q-PCR)：
定量 PCR，用來測定樣本中的靶 DNA 的量。最初的定量 PCR 主要是指 Competitive PCR（競爭定量 PCR）。競爭定量 PCR：在反應混合物中加入起始拷貝數已知的內部對照，對照具有同靶序列相同的引物結合位點，但產生的產物長度與靶序列產生的產物長度不同，在 PCR 過程中對照與靶基因競爭相同的引物。反應後通過比對對照和靶基因產生的產物量推斷初始靶基因的拷貝數，由於內部對照和靶基因在擴增中的效率不一定相同，所以定量結果會產生偏差。
Real-Time PCR：
實時 PCR，由於通常的 PCR 在幾十個循環後都會進入平台期，產物的量與初始模板量不在成正比，因此只能用來定性。而實時 PCR 通過使用熒光染料，例如 SYBR Green 或熒游標記探針，例如 TaqMan 可用來檢測隨著擴增的進行，產物量的變化而進行定量。

C. 有誰做過通用熒光引物多重PCR嗎做過的可以指點一下，謝謝咯！

普通的SYBR green 法不能做來這種實驗，只自有Taqman 探針才可以，ABI的儀器有5通道的，理論上可以做四個熒光同時檢測，但是實際上不贊成這么做，一般同時做兩個沒問題，但是你的探針要設計好才行，也可以直接買ABI的成熟產品

D. 多重pcr如何設計引物

我們實驗室有很多人做多重PCR，其實也很簡單。如果你有3對引物進行PCR，第一保證每對引物單獨專擴增沒有問題。屬第二保證引物對之間的退火溫度相差不大，最好在3度內。第三，引物對與引物對之間形成的引物二聚體的△G的絕對值小於5。推薦使用oligo軟體設計引物，使用說明網路文庫有很多。當然，如果單對引物設計還存在問題，可以看如下鏈接http://wenku..com/view/12389815fc4ffe473368ab58.html，裡面介紹的很詳細。

E. 多重pcr引物設計應注意哪些問題

設計引物應遵循以下原則：
①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度專：以200-500bp為宜，特定條件屬下可擴增長至10kb的片段。
③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，
被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，
這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

F. 多重pcr引物設計的原理有哪些

• 1、多殺性巴氏桿菌的Km t 及toxA 基因 T +Pm具有Km t 及toxA 基因 T Pm具有Km t基因 PCR引物：

• P1: 5′- A TC CGC TA T TTA CCC A GT GG-3′ P2: 5′-GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC-3′ P3: 5′- CTT A GA TGA GCG ACA A GG-3′ P4: 5′- GAA TGC CAC ACC TCT A TA G-3′ 引物P1，P2檢測Pm,擴增片段為457bp; 引物P3，P3檢測T +Pm，擴增片段為864bp.

• 退火溫度56℃，時間30秒

• 2、禽多殺性巴氏桿菌基因序列（U51470） 引物：

• 上游引物：5』-TGC CAA AGT TGC CAA TAC TCC-3』 下游引物：5』-TCC CGT CCT CAT TTC TTG CG-3』

• 退火溫度45℃，時間1分鍾

• 3、豬巴氏桿菌

• 參考GenBank中豬巴氏桿菌序列設計引物

• 上游PAS1：5』-AgggCACgCAggCggACTTTTA-3』 上游PAS2：5』-ATCgACAgCgTTTACAgCgTggA-3』

• 退火溫度56.5℃，時間1分鍾

• 4、致病性嗜水氣單胞菌（ 嗜水氣單胞菌標准株Ah10501）

• 究針對GenBank 中登錄的致病性嗜水氣單胞菌的溶血素基因( hlyA ) 、氣溶素基因( aerA ) 以及為氣單胞菌屬所特有的內參照基因16S rRNA 保守區設計了3 對特異性引，非致病性分離株均未擴增出毒力基因hlyA 和aerA ,而致病性分離株則至少含有hlyA 基因

G. 多重pcr所用的引物可以用於普通pcr嗎

一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用於單一致病因子等的鑒內定·多重PCR(multiplex PCR)，又容稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系裡加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同·

H. 多重PCR引物設計

這個要看你准備設計多少重了，如果是做taqman定量PCR，一般也就2-4重，引物之間互相干擾專比較小，如果是做毛細管屬電泳，那一般在5-40重，引物之間影響就比較大了

如果需要設計定量PCR引物，可以參考網頁鏈接

I. 怎麼用primer 5設計 multiplex PCR的引物

你先了解下多重PCR