引物設計

① 引物設計中的F、R表示什麼

正向引物，反向引物。

引物自身及引物之間不應存在互補序列。連續互補的鹼基應該要少於4 個。引物應使其G值不要太高，G值越大，則雙鏈越穩定。

引物長度和GC 含量要適中。引物長度大概為18~28 bp，但不應大於38 bp，引物過短會影響到擴增的特異性，太長的話其延伸溫度將會大於74 ℃，不利Taq 酶的催化反應。若擴增產物為4~5 kb，引物最好不要少於24bp。

(1)引物設計擴展閱讀：

注意事項：

1、引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA聚合酶進行反應。 

2、鹼基要隨機分布：引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

3、3′端不應超過3個連續的G或C，如GGG或CCC，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。

4、引物3』端的末位鹼基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位鹼基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位鹼基為A的錯配效率明顯高於其他3個鹼基，因此應當避免在引物的3』端使用鹼基A。

② 如何看一個引物設計的好壞

通過引物的參數檢測
引物設計參數：

a
引物長度一般在20bp左右，上下游引物鹼基長度不要相差超過4個鹼基。

b
引物退火溫度一般在58度，不同軟體TM使用不同的演算法，primer3，primer
5，primer
6，primer
express等一般可以設置在55-58度，beacon
design可以設置在65左右。

c
GC含量一般沒什麼特殊要求，40-60最好，如果不好設計，30-80也是可以的。

d
產物長度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那樣和引物二聚體不好區分，超過200bp可能會影響PCR擴增。

e
軟體給出的引物不能有發卡結構和超過3-4個鹼基的匹配，特別是3`端不能有鹼基匹配，那樣更容易形成二聚體。

f
引物設計好以後，在NCBI上做一個primer-blast，檢測一下是否有非特異性擴增。

最好還是通過實驗驗證，如果是定量PCR引物
a
溶解曲線單峰，窄而尖，否則可能有非特異性擴增；峰的位置橫坐標一般在80度以上，這個溫度為PCR產物的解鏈溫度，如果在75度附近，可能是引物二聚體，miRNA染料法檢測時，溶解曲線的峰的位置可能在75度附件

b
瓊脂糖電泳為明亮的一條帶，條帶一般在100bp以上，如果設計引物時PCR產物在100bp一下，需要仔細辨認是否為引物二聚體；引物二聚體的條帶一般在50bp左右，條帶彌散，暗。

c
擴增曲線呈「S」形，一般情況下，S形越陡，擴增效率越高，S形越平，擴增效率低。有時會出現擴增曲線只有線性期，沒有指數期的情況，這時一般擴增效率較低，建議檢測一下擴增效率，用標准曲線法計算相對表達量。染料法的擴增曲線比探針法的擴增曲線要好看。

d
樣品Ct值小於30，對於Ct大於30的情況，建議重新設計一對引物，重新調試。如果幾對引物的Ct值都較大，可以適當放寬Ct至35。但是Ct值肯定不能大於35。

③ 引物設計的引物設計原則

1、長度：15—30bp，其來有效長度[Ln=2(G十源C)十(A十T)]一般不大於38，否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產物的特異性。
2、G十c含量：應在40%一60%之間，PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5—10度。引物長度小於20時，其Tm恆等於4×(G十C)十2×(A十T)。
3、鹼基分布的隨機性：應避免連續出現4個以上的單一鹼基。尤其是不應在其3』端出現超過3個的連續G或C，否則會使引物在G十C富集序列區錯誤引發。
4、引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成發夾樣二級結構。
5、引物之間：兩個引物之間不應有多於4個的互補或同源鹼基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3』端的互補重疊。
6、上下游引物的互補性：一個引物的3『末端序列不允許結合到另一個引物的任何位點上。
7、3』末端：如果可能的話，每個引物的3『末端鹼基應為G或C。
8、引物應當超出限制性內切酶識別位點至少3個核苷酸。

④ 引物設計時為什麼要設計兩個他們兩個是什麼關系

引物 (primer)
引物，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，存在於自然中生物的DNA復制（內RNA引物）和聚合酶鏈容式反應(PCR)中人工合成的引物（通常為DNA引物）。引物（DNA，RNA的） primer 指在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。
在PCR（聚合酶鏈式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，
引物的結合目的基因DNA受熱變性後解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復循環，延伸後得到的產物同樣可以和引物結合。

⑤ 引物設計的、軟體有哪些有什麼優點和缺點

引物設計相關軟體！
NoePrimer 2.03 獨特的引物設計軟體
Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析與引物設計，非常棒的一個軟體。
Oligo 7.36 Demo 引物設計分析著名軟體，主要應用於核酸序列引物分析設計軟體。
Primer D'Signer 1.1 免費的引物設計輔助軟體，專門用於pASK-IBA和pPR-IBA表達載體，簡化引物設計工作。
Array Designer 4.25 Demo DNA微陣列（microarray）軟體，批量設計DNA和寡核苷酸引物工具。
Beacon Designer 7.80 Demo 實時熒光定量PCR分子信標(Molecular beacon )及TaqMan探針設計軟體。
NetPrimer JAVA語言寫成的免費引物設計軟體，用IE打開運行。
TGGE-STAR DOS軟體，PCR結合梯度凝膠電泳實驗引物設計軟體。
e-PCR 2.3.9 電子克隆是一種電腦軟體，用來識別DNA序列標簽位點（STSs)。
FastPCR 6.0.165b2 快速設計各種類型PCR引物，還包括一些常用的DNA與蛋白序列軟體工具；
OligoMaster 1.0.164 多用戶寡核苷酸管理軟體，可建立寡核苷酸資料庫
PerlPrimer v1.1.19 一個免費的用來設計引物的開源軟體。
AmplifX 1.5.4 設計與管理引物的軟體。
AutoDimer 1.0 快速篩選二聚體引物軟體。
MutaPrimer 1.00 用於定點突變的引物設計桌面工具軟體
ORFprimer 1.6.4.1 JAVA語言設計的引物設計軟體
Primer Prim'er 5.6.0 Flash製作的PCR引物設計軟體。
PCR Analyzer 1.0 實時RT-PCR反應中估算初始擴增子濃度軟體
在線工具
DNAWorks 3.0 是一個幫助進行基因合成的設計寡核苷酸序列的免費程序。 程序僅需要輸入一些簡單的信息，比如，目標蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的溫度。程序輸出的為適合所選擇生物表達的優化密碼子的核酸序列。利用DNAWorks的幫助，用兩步PCR法，可以成功合成長度達到3000鹼基對的基因。原始網站。
The Primer Generator 在線引物設計程序。
Primer 3 比較有名的在線引物設計程序。
Primo Pro 3.4 在線PCR引物設計java系列軟體。
Web Primer 斯坦福大學提供的在線引物設計軟體。
AutoPrime 快速設計真核表達實時定量PCR引物在線軟體 .

一般性引物自動搜索可採用「Premier Primer 5」軟體，而引物的評價分析則可採用「Oligo 6」軟體。

附上兩款軟體使用方法！
Primer Premier 5.0 的使用技巧簡介
1. 功能
「Premier」的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設計( )、限制性內切酶位點分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。「Premier」還具有同源性分析功能（ ），但並非其特長，在此略過。此外，該軟體還有一些特殊功能，其中最重要的是設計簡並引物，另外還有序列「朗讀」、DNA 與蛋白序列的互換（ ）、語音提示鍵盤輸入（ ）等等。
有時需要根據一段氨基酸序列反推到DNA 來設計引物，由於大多數氨基酸（20 種常見結構氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時，會遇到部分鹼基的不確定性。這樣設計並合成的引物實際上是多個序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡並引物。遺傳密碼規則因物種或細胞亞結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的。「Premier」可以針對模板DNA 的來源以相應的遺傳密碼規則轉換DNA 和氨基酸序列。軟體共給出八種生物亞結構的不同遺傳密碼規則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）、無脊椎動物線粒體（Invertebrate Mitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（Plant Mitochondrion）、原生動物線粒體（Protozoan Mitochondrion）、一般標准（Standard）、脊椎動物線粒體（Vertebrate Mitochondrion）和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步驟及技巧
「Premier」軟體啟動界面如下：
(轉載的時候就沒有圖)
其主要功能在主界面上一目瞭然（按鈕功能如上述）。限制性酶切點分析及基元查找功能比較簡單，點擊該功能按鈕後，選擇相應的限制性內切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按確定即可。常見的限制性內切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制性內切酶或基元。
進行引物設計時，點擊按鈕，界面如下：
進一步點擊按鈕，出現「search criteria」窗口，有多種參數可以調整。搜索目的（Seach For）有三種選項，PCR 引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交****（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據自己的需要設定各項參數。如果沒有特殊要求，建議使用默認設置。然
後按，隨之出現的Search Progress 窗口中顯示Search Completed 時，再按，這時搜索結果以表格的形式出現，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，並按優劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標基本都能達標（如下圖）。
點擊其中一對引物，如第1#引物，並把上述窗口挪開或退出，顯示「Peimer Premier」主窗口，如圖所示：
該圖分三部分，最上面是圖示PCR 模板及產物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質，最下面是四種重要指標的分析，包括發夾結構（Hairpin），二聚體（Dimer），錯誤引發情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當所分析的引物有這四種結構的形成可能時，按鈕由變成，點擊該按鈕，在左下角的窗口中就會出現該結構的形成情況。一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應用。
在需要對引物進行修飾編輯時，如在5』端加入酶切位點，可點擊，然後修改引物序列。若要回到搜索結果中，則點擊按鈕。如果要設計簡並引物，只需根據源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規則，反推至DNA 序列即可。對簡並引物的分析不需像一般引物那樣嚴格。總之，「Premier」有優秀的引物自動搜索功能，同時可進行部分指標的分析，而且容易 使用，是一個相當不錯的軟體。

Oligo 6.22 使用技巧簡介
1. 功能
在專門的引物設計軟體中，「Oligo」是最著名的。它的使用並不十分復雜，但初學者容易被其復雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0 的初始界面是兩個圖：Tm 圖和ΔG 圖；Oligo 6.22 的界面更復雜，出現三個圖，加了個Frq 圖。「Oligo」的功能比「Premier」還要單一，就是引物設計。但它的引物分析功能如此強大以至於能風靡全世界。
2. 使用（以Oligo 6.22 為例）
Oligo 6.22 的啟動界面如下：
圖中顯示的三個指標分別為Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，為鄰近6至7 個鹼基組成的亞單位在一個指定資料庫文件中的出現頻率。該頻率高則可增加錯誤引發的可能性。因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade 排列方式不太方便，可從windows菜單改為tili 方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標，如Frq，這樣界面的結構同於Oligo5.0，只是顯示更清楚了。
經過Windows/Tili 項後的顯示如圖：
在設計時，可依據圖上三種指標的信息選取序列，如果覺得合適，可點擊Tm 圖塊上左下角的Upper 按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。∆G 值反映了序列與模板的結合強度，最好引物的∆G 值在5』端和中間值比較高，而在3』端相對低（如圖：）
Tm 值曲線以選取72℃附近為佳，5』到3』的下降形狀也有利於引物引發聚合反應。Frq 曲線為「Oligo 6」新引進的一個指標，揭示了序列片段存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用3』端Frq 值相對較低的片段。
當上下游引物全選好以後，需要對引物進行評價並根據評價對引物進行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3』端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測（非克隆）性PCR，對引物位置、產物大小要求較低，因而應盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發夾結構（hairpin）；與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。一般來說，這兩項結構的能值以不超過4.5 為好。
當然，在設計克隆目的的PCR 引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發夾結構，而且能值不會太低。這種PCR 需要通過靈活調控退火溫度以達到最好效果，對引物的發夾結構的檢測就不應要求太高。第三項檢查為GC 含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導致引物的GC 含量不能被控制在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利於退火溫度的選擇。如果PCR 的模板不是基因組DNA，而是一個特定模板序列，那麼最好還進行False priming site 的檢測。這項檢查
可以看出引物在非目的位點引發PCR 反應的可能性。如果引物在錯配位點的引發效率比較高，就可能出假陽性的PCR 結果。一般在錯配引發效率以不超過100 為好，但對於特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發效率為450 以上，而在錯誤位點的引發效率為130，那麼這對引物也是可以接受的。當我們結束以上四項檢測，按Alt+P 鍵彈出PCR 窗口，其中總結性地顯示該引物的位置、產物大小、Tm 值等參數，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評價。
由於「Oligo」軟體的引物自動搜索功能與「Primer Premier 5」的相類似，並且似乎並不比後者更好用，在此不再贅述。其實，使用軟體自動搜索引物就是讓計算機按照人的要求去尋找最佳引物，如果參數設置得當將大大提高工作效率。
除了本地引物設計軟體之外，現在還有一些網上引物設計軟體，如由Whitehead Institute開發的「Primer 3」等（本網站http://210.72.11.60/ 已引進並調試好該軟體，歡迎使用）。該軟體的獨特之處在於，對全基因組PCR 的引物設計；可以將設計好的引物對後台核酸資料庫進行比對，發現並排除可引發錯配的引物。因此建議經常做全基因組PCR 的用戶試用。

⑥ 如何設計引物

2.在框中粘貼入你的原始序列(要比你要擴的目的片段兩端延伸一點) 3.在框的下方有許多可以設定的限制條件,如片段長度,一定包含的片段位置,引物長度,引物退火溫度等,你可以進行設定 4.點擊"pickup primers"就會出現下一頁,上面會列出多種設計，一般來說，第一對引物是最適合的。 同時引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則： (1) 引物長度約為16-30bp，太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。 (2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). (3) 四種鹼基應隨機分布，在3'端不存在連續3個G或C,因這樣易導致錯誤引發。 (4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應, 以減少由於密碼子擺動產生的不配對。 (5) 在引物內, 尤其在3'端應不存在二級結構。 兩引物之間尤其在3'端不能互補, 以防出現引物二聚體, 減少產量。兩引物間最好不存在4個連續鹼基的同源性或互補性。 (7) 引物5'端對擴增特異性影響不大, 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等. 通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護鹼基。 引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構, 以免產生非特異性擴增,影響產量。 (9) 簡並引物應選用簡並程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應不存在簡並性。否則可能由於產量低而看不見擴增產物。

⑦ 請教引物設計

VECTOR設計引物必須為特異性性引物首先需要注意酶切位點位置。其次為了保證得到完整的酶切位點及准確性一般距離位點50-100BP鹼基處設計引物.設計引物具體原則如下：
測序用引物要求非常嚴格，不同於PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板結合，3』端的幾個鹼基能完全配對，即使引物長達80～100多個鹼基，只要調整PCR反應條件，也能成功進行PCR反應。而測序用引物便不一樣了，必須嚴格符合以下要求。

(1)長度在18～25個鹼基左右，一般選擇20個鹼基(根據GC含量作適當調整)，
(2)3』端盡量選擇G或C鹼基(但不絕對)，以增加與模板的結合能力。
(3)Tm溫度應選擇50℃～70℃左右。
(4)GC含量應選擇在50%左右，盡量避開A、T、G、C的連續結構。
(5)避開引物自身形成發夾結構或引物二聚體結構等復雜結構。
(6)保證引物和模板100%匹配，特別是3』端的幾個鹼基一定要100%匹配。同時必須嚴格保證引物和模板之間只能有一個結合位點。

⑧ 「引物」設計的原則是什麼

引物設計有 3 條基本原則：

• 引物與模板的序列要緊密互補。

• 引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構。

• 再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。

⑨ 引物設計

NoePrimer：獨一無二的引物設計工作站

NoePrimer是獨特的引物設計軟體，它可以把繁雜的引物設計過程簡單化，滿足您復雜而專業的設計需要。

NoePrimer為引物設計提供了簡單的、直觀的、圖形化的模板和引物序列展示。它不但能進行常規PCR引物、雜交探針和測序引物的設計，同時，它還能進行多重PCR引物分析以及高通量的引物搜索和查找功能。

NoePrimer的與眾不同之處在於:
1.界面清晰、方便友好且擁有豐富的序列信息。
2.易學易用。只需要簡單的按幾個按鈕或自動搜索就可以設計您需要的引物。
3.直觀的圖形化展示PCR產物、發夾結構、引物二聚體和錯配，方便您的分析。
4.設計和搜索多重引物，包括PCR引物、序列探針和測序引物。並具有高通量的多序列引物搜索功能。
5.靈活而強大的參數設置，包括添加接頭和查找與已經存在的引物相配的引物。
6.跟蹤引物。可以輕易的把引物保存於引物庫中，並可以訂購所選的引物。
7.整合圖形化序列特徵，進一步協助您設計引物。
8.實行中英文界面互換

⑩ 簡述引物設計的基本原則

1.PCR技術基本原理：PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 2.PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。 3.PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。 4.PCR的特點：特異性強。對標本的純度要求低。靈敏度高。 5.PCR反應的特異性決定因素為： ①引物與模板DNA特異正確的結合； ②鹼基配對原則； ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性； ④靶基因的特異性與保守性。